赤道幾內亞比奧科島居民的鐮型紅細胞病的流行病學調查

謝東德陳江濤Urbano Monsuy EyiRocio Apicante MatesaMaximo M iko Ondo ObonoCarlos Sala Ehapo岳亮郭翼華古杰超詹小芬楊輝楊惠鈿楊立業林敏★

·論著·

赤道幾內亞比奧科島居民的鐮型紅細胞病的流行病學調查

謝東德1，2陳江濤1，3Urbano Monsuy Eyi4Rocio Apicante Matesa4Maximo M iko Ondo Obono5Carlos Sala Ehapo5岳亮6郭翼華2古杰超2詹小芬6楊輝6楊惠鈿6楊立業6林敏6★

目的了解非洲赤道幾內亞比奧科島（Bioko Island）人群的鐮刀形紅細胞病（sickle cell disease，SCD）的流行病學特點。方法在2013年1月至12月期間，采用紅細胞鐮變試驗對1 036名本島居民進行篩查。用高分辨熔解曲線（high-resolution melting，HRM）分析和PCR-DNA測序法對篩查陽性的標本進行基因型鑒定。結果赤道幾內亞比奧科島居民的SCD發生率為16.99％（176／1 036）。HRM法與PCR-DNA測序法具有較好的一致性（100％）。結論比奧科島是SCD高發區，當地政府和衛生部門應采取有效的干預措施來減少這種疾病的危害。HRM法對SCD的鑒定準確性較高。

鐮刀形紅細胞病；比奧科島；高分辨熔解曲線分析；PCR-DNA測序

鐮刀形紅細胞病（sickle Cell Disease，SCD）是世界范圍最為常見和臨床上最重要的一種常染色體隱性遺傳血紅蛋白病，它是由β珠蛋白基因的6號密碼子GAG＞GTG突變而成的血紅蛋白S（hemoglobin S，HbS）導致的［1］。該病的純合子表型能夠導致胎兒死產或成年前死亡，而雜合子表型能導致貧血、感染合并癥、慢性器官損害等一系列并發癥［2－3］。全世界每年大約有30萬的新生兒受到鐮刀形紅細胞病的影響，其中75％的病例發生在撒哈拉沙漠以南的非洲地區［1，4］。對于鐮刀紅細胞貧血，目前只能依靠長期輸血治療，此外就是應用基因診斷技術進行產前診斷，降低人群的發病率［5］。

比奧科島（Bioko Island），是一個位于非洲幾內亞灣中的島嶼。該島距尼日利亞南部海岸約100公里，在非洲西部大陸赤道幾內亞西北160公里處，是赤道幾內亞共和國的首都馬拉博（Malabo）的所在地。全島有居民26萬人，瘧疾感染率高達29.8％。該國的醫療衛生水平低，人民生活條件差，是瘧疾和鐮刀形紅細胞病的高度流行區和高發地區，由于當地落后的經濟和技術，目前沒有任何鐮刀形紅細胞病的流行病學的數據。

自1971年開始，廣東省承派援助赤道幾內醫療隊幫助當地居民治療瘧疾及其他基礎疾病。因此，我們在馬拉博地區醫院的支持下，對比奧科島進行了一次聯合的流行病學調查，總結如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2013年1月至2013年12月，1 036名比奧科島的當地居民（年齡：1～84歲，95％的個體為超過18歲的成人），參與了我們的調查，含男性535名，女性501名。在取得馬拉博地區醫院倫理委員會和患者或其監護人的同意后，在馬拉博地區醫院檢驗科用EDTA-K2真空管抽取外周血2 m L，同時用903標本采集濾紙（Whatman-新華公司）制備干血斑，干燥后4℃保存備用。

1.2 儀器及耗材

LightCycle 480II熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司），MJm im i型梯度PCR擴增儀（美國Bio-Rad），微量加樣器（德國Eppendorf公司），超凈工作臺（中國蘇州精華設備有限公司），干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司），TGL-20B型和TGL-28C-C型臺式高速離心機（上海安亭科學儀器廠），LightCycle 480II熒光定量PCR儀專用96孔PCR板及封板膜（荷蘭Bioplastics公司）。

1.3 紅細胞鐮變（HbS）試驗

按照《全國檢驗操作規程》［6］第三版進行操作，步驟如下：（1）在清潔載玻片上被檢鮮血1滴，然后加20 g／L的偏重亞硫酸鈉液1滴混勻；（2）加蓋玻片，避免氣泡，用凡士林液體石蠟合劑封固，置于37℃溫箱；（3）在溫育15 m in、30 m in、1 h、2 h及12 h后分別用高倍顯微鏡觀察有無鐮狀紅細胞形成，同時用正常人做對照檢查。

1.4 DNA提取

按照本實驗室以往文獻［7］，用Chelex-100法提取所有紅細胞鐮變試驗篩查陽性者的干血斑樣本DNA，步驟如下：首先剪取0.5 cm×0.5 cm血斑，加入500μL蒸餾水，震蕩30 s，然后靜置半小時以上，然后用13 600 rpm離心4 m in，棄上清；加入160μL的10％濃度的Chelex-100，振蕩后用56℃孵育2 h，接著98℃變性8 m in，振蕩30 s，13 500 rpm離心1 m in，最后置于冰箱4℃冷卻30 m in以上，吸取上清進行PCR擴增。

1.5 高分辨熔解曲線（high-resolution Melting，HRM）分析

根據本實驗室以往建立的HRM鑒定HbS的方法［8］，針對導致血紅蛋白S的HBB：c.20 A＞T位點，采用如下引物：HRM-S-F：5′-CACCATGG TGCATCTGACTCC-3′；HRM-S-R：5′-CACCAA CT TCATCCACG TTCA-3′。反應體系總體積20 μL，包括0.2μL的HotStat DNA聚合酶（大連寶生物工程公司），4μL的5×PCR buffer（Mg2＋plus），1.6μL的脫氧核苷三磷酸（dNTP，10 mmol／μL），上述引物各1μL（5μmol／μL），9.2 μL的雙蒸滅菌水，1μL的LC GreenⅠ染料（北京思博全）和2μL模板DNA。PCR擴增及熔解曲線分析均在LightCycle 480Ⅱ熒光定量PCR儀上進行，PCR擴增參數如下：預變性95℃3 m in；擴增98℃10 s，68℃15 s共45個循環。熔解曲線鑒定程序如下：95℃1 m in，40℃1 m in，熔解曲線數據收集從60℃至95℃，溫度上升為1℃／s，且每升高1℃進行25次的數據采集，最終采用LightCycle 480Ⅱ軟件對進行分析。

1.6 PCR-DNA測序

對于HRM鑒定為HbS突變的樣本，用PCRDNA測序進一步確認。采用本實驗以往建立的β珠蛋白基因測序引物［9］，擴增體系為為25μL，包括2μL模板DNA，12.5μL PCR混合M ix（北京艾德來），上下游引物各1μL，純凈水8.5μL。擴增后用以2％的瓊脂糖凝膠電泳對產物進行鑒定，然后純化后用ABI3730雙向測序，查找突變點。

1.7 統計學分析

采用IBM＠SPSS 16.0軟件進行統計學分析。按Hardy-Weinberg平衡公式，當P＜0.05時，說明群體基因遺傳平衡，數據來自同一孟德爾遺傳群體。

2 結果

在1 036名參加篩查的比奧科島居民中，高達16.99％（176／1 036）的樣本的紅細胞鐮變試驗篩查陽性，如圖1所示，絕大多數陽性的血樣在60 m in以后鐮變現象就變得明顯，只有1例1周歲以下的嬰兒的60 m in的鐮變現象不太明顯，但24 h時依然可以觀察到一定比例的鐮刀形紅細胞。我們認為，這應該是該嬰兒的血液里面還有較多含量的HbF，因此降低了HbS的比例，使紅細胞鐮變的現象減弱。

圖1 紅細胞鐮變（HbS）試驗檢測結果Figure 1 The results of sickle solubility test

所有的篩查陽性結果，均用高分辨熔解曲線（圖2）和PCR-DNA測序分析（圖3）。我們發現鐮刀形紅細胞病雜合子表型（c.20 A＞T雜合子）的曲線很容易和正常人（野生型）曲線區分。176例樣本通過HRM和PCR-DNA測序法均鑒定為鐮刀型紅細胞病雜合子，基因頻率為16.99％（176／1 036），2種方法的符合率100％。由于我們的樣本絕大多數采集自島上的成人，而且鐮刀形紅細胞病患者的純合子在胎兒時就死產或成年前死亡，因此數據不能符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝8.927，P＝0.002）。

圖2 高分辨熔解曲線分析結果Figure 2 The results of HRM assay and PCR-DNA sequencing

圖3 PCR-DNA測序結果Figure 3 The results of PCR-DNA sequencing

3 討論

鐮刀形紅細胞病是世界上危害最為嚴重的一種單基因遺傳病，純合子表型能夠導致胎兒的死產或需要長期輸血才能存活；雜合子表型導致患者體內的紅細胞容易破壞且堵塞血管，會造成局部缺血、貧血、感染合并癥、慢性器官損害等一系列并發癥使患者的壽命縮短到40歲左右［2－3］。與非洲中部報道的10％至40％的發生率一致［10－12］，比奧科島居民鐮刀形紅細胞病發生率也高達16.99％。基于這個調查數據，按照Hardy-Weinberg平衡公式進行估算，即在本島26萬居民之中大約有4萬人的雜合子著存在，同時也造成每250個婦女懷孕就會產生1個純合子，給當地居民的健康和社會經濟造成嚴重的影響。赤道幾內亞是一個發展中國家，缺乏足夠的人力和物力進行流行病學的調查，本研究提供了比奧科島鐮刀形紅細胞病的流行病學資料，為比奧科島當地的衛生部門制定鐮刀形紅細胞病防控政策提供了參考。

傳統的鐮刀紅細胞病診斷方法，包括紅細胞鐮變試驗、血紅蛋白電泳、AMRS-PCR和PCR限制性片段多態性（PCR-RFLP），存在著耗時長、操

作繁瑣、PCR產物污染等各種缺陷，不利于大規模的人群篩查。HRM分析是新近發展起來的高效基因檢測技術，具有靈敏度高、特異性強、高通量和成本低廉等優點，非常適合單個堿基或幾個堿基的變化檢測［13］。在我們的研究中發現雜合子DNA能夠準確的與野生型DNA區分開來。Chelex-100法提取血斑DNA操作簡單，價格便宜，再結合HRM法的優點，合適在非洲地區推廣針對鐮刀紅細胞病進行大規模的人群調查和遺傳學研究。

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Epidem iological investigation of the sickle cell disease in local inhabits on Bioko Island,Equatorial Guinea

XIE Dongde1,2,CHEN Jiangtao1,3,Urbano Monsuy Eyi4,Rocio Apicante Matesa4,Maximo M iko Ondo Obono5,Carlos Sala Ehapo5,YUE Liang6,GUO Yihua2,GU Jiechao2,ZHAN Xiaofen6,YANG Hui6,YANG Huitian6,YANG Liye6,LIN M in6★
(1.The Chinese Medical Aid Team to the Republic of Equatorial Guinea,Guangzhou,Guangdong,China, 510000；2.Department of Medical Laboratory Science,Jiangmen People's Hospital,Jiangmen,Guangdong, China,529020；3.Laboratory Medical Center,The Huizhou Central Hospital,Huizhou,Guangdong,China, 516001；4.Central Blood Transfusion Service,Hospital Regional De Malabo,Malabo,The Republic of Equatorial Guinea；5.Department of Medical Laboratory Science,Hospital Regional De Malabo,Malabo, The Republic of Equatorial Guinea；6.Laboratory Medical Center,Chaozhou Central Hospital,Southern Medical University,Chaozhou，Guangdong,China，521021)

Objective To investigate the epidem iological characteristics of the s ickle c ell d isease（SCD）in local inhabits on Bioko Island,Equatorial Guinea.Methods During January 2013 to December 2013,1 036 local inhabits were screened for SCD by sickle solubility test.Then,all the screening positive

Sickle Cell Disease；Bioko Island；H igh-resolution melting assay；PCR-DNA sequencing

中國博士后科學基金（2013M 542195）；國家自然科學基金（81101329）

1.中國第二十六批援赤道幾內亞醫療隊，廣東，廣州510000 2.江門市人民醫院檢驗科，廣東，江門529020 3.惠州市中心醫院醫學檢驗中心，廣東，惠州516001 4.赤道幾內亞共和國馬拉博市馬拉博地區醫院中心血站，赤道幾內亞5.赤道幾內亞共和國馬拉博市馬拉博地區醫院醫學檢驗科，赤道幾內亞6.潮州市中心醫院中心實驗室，廣東，潮州521021

★通訊作者：林敏，E-mail：konfutea＠hotmail.com

samples were identified by high-resolution melting(HRM)assay and PCR-DNA sequencing.Results The prevalence of SCD in local inhabits on Bioko Island was 16.99％(176/1 036).SCD could all be efficiently identified by HRM analysis，and 100％concordance was found between the HRM analysis and the r PCRDNA sequencing.Conclusion High prevalent SCD on Bioko Island indicated that the local health department and government should make efficiently strategy for the control of SCD in the region.HRM assay is a rapid,low-cost,accurate and high-throughput method to screen for SCD which is worthy to promote its use in high-prone areas of SCD in A frica.