甘藍細胞質雄性不育材料的分子鑒定

劉嬌嬌，王超，王帥

（東北農業大學園藝學院，黑龍江哈爾濱，150030）

結球甘藍（Brassica oleraceaL.var.capitataL.），屬十字花科蕓薹屬，為一種重要的蔬菜類作物。由于不結球白菜雜種優勢非常明顯，目前國內外主要推廣的品種大多數為F1代。不結球白菜雜種一代過去主要采用自交不親和系繁殖，但繁殖成本較高，且親本生活力易下降，制種時雜交率很難達到100%，容易出現假雜種；利用雄性不育系制種，不僅親本繁殖容易、雜種一代純度高，而且有利于新品種的自身保護。

細胞質雄性不育（CMS）是一種不能產生有活力花粉的母性遺傳現象，是由線粒體基因組的重排引起的。CMS相關基因產生一種新的蛋白質，直接或間接破壞線粒體正常的生理功能[1]，從而導致花粉敗育，研究證明，高等植物CMS與其線粒體基因密切相關。目前比較常見的不育類型主要有波里馬不育胞質（Pol CMS）、蘿卜不育胞質（Ogu CMS）和甘藍型油菜不育胞質（Nap CMS）等。蕓薹屬中波里馬不育胞質、蘿卜不育胞質研究較多，二者利用比較廣泛[2～4]。研究發現，幾乎所有的細胞質雄性不育均與線粒體基因變異有關，其中起主要作用的是重要基因和未知片段重組形成的開放讀碼框（ORF）。人們在分子鑒定方面對不育類型進行了研究，可以有效區分CMS類型。張德雙等[5]利用orf138引物證實了所獲得的白菜CMS96胞質不育系mtDNA的特異序列與Ogu CMS有高度同源，為Ogu CMS不育類型。王春國等[6]通過設計orf138特異引物對花椰菜細胞質雄性不育系和保持系進行了PCR擴增，證明所用細胞質不育材料為Ogu CMS不育類型。

本試驗通過提取甘藍細胞質雄性不育材料PM和QM mtDNA，設計orf138特異引物對其mtDNA進行PCR擴增，進而通過同源比對來鑒定PM和QM雄性不育的類型，證明2個雄性不育材料的分子類型，為今后研究甘藍雄性不育的分子機制提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2個甘藍細胞質不育品系PM和QM。

1.2 試驗方法

①黃化苗的培育 首先取甘藍種子1 g左右，用清水沖洗干凈，浸泡30 min，然后放置在無菌瓶中，于28℃暗培養 7～10 d（定期更換補充燒杯內水源），長出的黃化幼苗即可作為試驗材料。

②mtDNA提取試劑 DNaseⅠ、RNase A、蛋白酶K均為Takara產品，其余均為國產分析純。a.勻漿緩沖液。0.4 mol/L甘露醇；50 mmol/L Tris-HCl，pH值 7.5；20 mmol/L EDTA-Na2；1.0 mol/L NaCl；0.2%BSA；0.1%半胱氨酸；1%PVP（BSA、半胱氨酸和PVP在試驗前加）。

b.酶解緩沖液。0.4 mol/L甘露醇；50 mmol/L Tris-HCl，pH 值 7.5；10 mmol/L MgCl2；0.1%BSA（試驗前加）。

c.Shelf緩沖液。0.5 mmol/L甘露醇；10 mmol/L Tris-HCl，pH 值 7.5；20 mmol/L EDTA-Na2。

d.裂解緩沖液。50 mmol/L Tris-HCl，pH 值 8.0；20 mmol/L EDTA-Na2；5%SDS；0.1 mol/L NaCl；0.01%β-巰基乙醇。

e.EDTA溶液。0.5 mol/L，pH值8.0。

f.DNaseⅠ溶液。1 U/mL。

g.蛋白酶K溶液。20 mg/mL。

h.乙酸鈉溶液。3 mol/L。

③線粒體提取 a.稱取20 g結球甘藍黃化苗，在冰水中沖洗10 min后擦干，放入盛有100 mL勻漿緩沖液的燒杯中，置于4℃冰箱15～30 min（黑暗條件下）。

b.在勻漿機中高速勻漿，每次約15 s，重復5次。用8層紗布過濾勻漿液于預冷的50 mL離心管中，濾液于1 000 r/min離心10 min。

c.取上清液2 000 r/min離心10 min后，再取上清液于2 000 r/min離心15 min，重復1次，棄上清液，得到粗線粒體沉淀。

d.向每管沉淀中加入20 mL預冷的勻漿緩沖液，懸浮沉淀，于20 000 r/min離心15 min，充分棄掉上清液，得粗線粒體沉淀。

e.在粗線粒體沉淀中加入1 mL預冷的酶解緩沖液，懸浮沉淀于2個離心管中，后每管加入5 mL酶解緩沖液，15 mL DNaseⅠ，混勻后室溫放置，每5 min輕輕搖動懸浮液1次，30 min后放入冰浴中1 h。之后每管加入600 μL EDTA溶液，混勻后室溫靜止10 min終止DNaseⅠ消化反應。

f.將上述溶液小心鋪于Shelf緩沖液上（每管25 mL），于18 000 r/min離心20 min后收集沉淀。再用6 mL酶解緩沖液重新懸浮線粒體沉淀，并將懸浮液緩慢鋪于Shelf緩沖液上（每管15 mL），于18 000 r/min離心20 min，所得沉淀即為純化的線粒體。

④mtDNA提取方法 a.向每管沉淀中加入6 mL酶解緩沖液，輕輕混勻后，分裝到6個2 mL離心管中，于18 000 r/min離心15 min后棄上清液。

b.每管沉淀中加入0.9 mL裂解緩沖液，5 μL蛋白酶K，用槍頭吸打沉淀，使沉淀在裂解緩沖液中混勻，65℃水浴1 h，同時輕搖。

c.向裂解液中加入100 mL NaAc，然后加入等體積的苯酚+氯仿+異戊醇混合液（三者體積比25∶24∶1），緩慢混勻 10 min 以上，12 000 r/min 離心10 min抽提DNA，收集上清液，并重復抽提一次。

d.向上清液中加入 RNaseA 酶（10 mL/mL），37℃條件下反應1 h，同時輕搖。

e.加入等體積的苯酚+氯仿+異戊醇混合液（三者 體 積 比 25∶24∶1），緩慢混勻 10 min 以上 ，于12 000 r/min離心10 min抽提DNA，收集上清液，并重復抽提一次。

f.向上清液中加入1/10體積的NaAc和2倍體積預冷的無水乙醇，-20℃過夜沉淀，于18 000 r/min離心20 min，收集沉淀。

g.沉淀用70%乙醇洗滌3次，置超凈工作臺上吹干，溶于30 mL超純水中，-20℃保存備用。

⑤引物設計與合成 根據orf224和orf138基因序列的保守區設計特異引物，委托蘇州金唯智公司進行引物的合成（表1）。

⑥PCR擴增 20 mL反應體系中含1×PCR緩沖液、2.0 mmol MgCl2、2.0 mmol dNTP、1 μL DNA、2條引物各 0.5 μmol、1 U Taq酶，用 ddH2O補足。PCR 擴增程序：94℃預變性 2 min；94℃變性 30 s，53℃（根據Tm設定）退火1 min，72℃延伸2 min，40個循環；72℃保溫延伸5 min，4℃下保存。擴增產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結束后在紫外燈下觀察照相。

⑦特異條帶回收、純化及mtDNA序列分析 按照大連寶生物有限公司試劑盒的使用說明方法回收純化，回收純化后的mtDNA于4℃貯存備用。連接體系為 5 μL，0.5 μL pGEM-T 載體，0.5 μL 連接酶，2.5 μL 2×連接酶，1.5 μL PCR 產物。經藍白斑篩選，EcoRⅠ酶切、電泳檢測后委托蘇州金唯智生物技術有限公司進行DNA測序。用DNAMAN軟件進行同源性序列比對分析。

2 結果與分析

2.1 甘藍不育材料mtDNA檢測結果

經測定，提取的mtDNA的OD260/OD280值在1.6～1.8，OD260/OD230>2.0，0.8%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，電泳條帶清晰（圖1），表明所提取的mtDNA質量滿足進行后面試驗的要求。

表1 基于orf224和orf138基因設計的特異引物

2.2 orf138和orf224特異引物的PCR結果

用設計的orf138、orf224特異引物對2個甘藍供試材料的mtDNA進行PCR擴增。用orf138設計的特異引物對2個甘藍材料進行PCR擴增，2個不育系PM、QM均擴增出350 bp左右的條帶（圖2）；而用設計的orf224特異引物對2個不育材料進行PCR擴增，不育系均沒有擴增產生條帶。

圖1 甘藍mtDNA的0.8%瓊脂凝膠電泳圖譜

圖2 orf138引物PCR擴增產物電泳圖譜

2．3 序列的同源性比較

利用pGEM-T載體連接，經藍白斑篩選，EcoRⅠ酶切、電泳檢測，條帶清晰明顯（圖3），故可以進行測序，選用orf138特異引物擴增出條帶的供試材料克隆進行測序。

利用DNAMAN軟件對測序結果進行分析，結果表明，這2個序列都與已知的蘿卜Ogura雄性不育線粒體基因組的部分序列存在很高的相似性，但是有個別位點存在差異，2個片段與Ogu型胞質不育蘿卜線粒體開放讀碼框orf138同源性均為92.55%（圖4），長度為297 bp，證明2個來源不同的甘藍雄性不育供試材料均屬于蘿卜細胞質不育類型Ogu CMS。

圖3 質粒EcoRⅠ酶切電泳圖

圖4 2個甘藍不育系與Ogu CMS蘿卜orf138核苷酸序列同源性比較

3 討論與結論

在十字花科作物的細胞質雄性不育材料中，已經發現了很多特異性存在于不育系的開放閱讀框中，如不育系甜菜的orf239、蘿卜的orf138、白菜的orf222、油菜的orf224及芥菜的orf220等[7]。Ogu CMS是于1968年在日本鹿兒島一個蘿卜品種留種田中發現的一種新型胞質不育系，是目前國內外十字花科蕓薹屬中應用較為廣泛的一種不育類型。李建斌等[8]利用多個結球甘藍胞質雄性不育材料，通過對orf138和orf222基因進行PCR，結果顯示其中的59個材料含有orf138。張艷等[9]利用Ogu CMS的orf138特異引物及Nap CMS和Pol CMS的共同引物，在15份甘藍CMS材料中鑒定出了有14份是Ogu CMS。本文通過已知引物設計了2組特異引物，發現orf138特異引物在甘藍雄性不育材料都有擴增產物，orf224特異引物在甘藍雄性不育材料沒有擴增產物。經測序分析后發現，這2個來源不同的甘藍雄性不育材料與Ogura型胞質不育蘿卜線粒體開放閱讀框orf138的同源性高達92.55%，表明這2個甘藍雄性不育材料均屬于Ogura胞質不育類型，為今后甘藍細胞質雄性不育系在育種中的應用奠定了基礎，并為實現優勢育種提供了分子依據。

鑒別雄性不育系的不育類型有助于掌握其遺傳規律和遺傳機理，為人工合成保持系或者合理利用雄性不育系提供理論基礎。本文通過利用PCR快速鑒定了2個甘藍細胞質雄性不育材料，證明了供試材料的細胞質雄性不育類型為Ogura胞質不育類型，為進一步有效地開展細胞質雄性不育系在育種中的應用奠定了基礎。

[1]Hanson M R.Plant mitochondrial mutations and male sterility[J].Annual Review of Genetics,1991,25:461-486.

[2]侯喜林，曹壽椿，吳志行.十字花科作物幾種主要細胞質雄性不育類型及其利用[J].長江蔬菜，1999（5）：1-3.

[3]朱玉英，吳曉光，龔靜，等.蘿卜胞質青花菜雄性不育系的選育及其利用[J].南京農業大學學報，2001，24（3）:15-18.

[4]周邦福，李顯石，石磊.天津型大白菜雄性不育系的選育及利用[J].湖南農業大學學報：自然科學版，2008，34（2）：190-192.

[5]張德雙，徐家炳，曹鳴慶，等.大白菜轉育新型甘藍型油菜細胞質雄性不育系的研究[J].華北農學報，2002，17（1）：60-63.

[6]王春國，宋文芹.花椰菜細胞質雄性不育基因特異PCR標記的篩選[J].遺傳，2005，27（2）：236-240.

[7]張明方，楊景華，陳竹君.十字花科作物細胞質雄性不育的分子機理[J].農業生物技術學報，2003，11（5）：538-544.

[8]李建斌，張海娟，余小林，等.結球甘藍細胞質雄性不育（CMS）類型的分子鑒定[J].分子植物育種，2009，7（6）：1 149-1 153.

[9]張艷，王小佳，李成瓊.甘藍細胞質雄性不育材料分子鑒定及花器官形態對核背景的響應[J].園藝學報，2010，37（6）：912-915.