腺相關病毒載體在各種細胞株中的感染效率及表達特性研究*

周昆明 李峰生 俞慶華 周丁華 高 玲

稿 約

腺相關病毒載體在各種細胞株中的感染效率及表達特性研究*

周昆明①李峰生②*俞慶華③周丁華②高 玲④*

目的：研究腺相關病毒載體(AAV)感染各類正常細胞和腫瘤細胞的效率，為相關研究提供參考。方法：利用脂質體將重組腺相關病毒的包裝質粒AAV-DJ、Helper以及表達綠色熒光蛋白(GFP)的穿梭質粒AAV-GFPP轉染293FT細胞進行病毒包裝，收集病毒液后感染2種正常細胞和14種腫瘤細胞，24 h后倒置熒光顯微鏡下觀察GFP的表達，并隨機選取3個視野統計感染GFP的細胞數目。結果：GFP重組腺相關病毒對各種細胞的感染效率存在差別，感染效率最高的為293FT細胞(占96.2%)和Hela細胞(占81.86%)，對SCG7901、SEM-M和SP20細胞的感染效率近乎為零。結論：GFP重組腺相關病毒對正常細胞293FT感染效率最高，對腫瘤細胞Hela、SMC7721、BGC823、PANC-1、A549、A875、C6和MCF-7的感染效率較高，這類細胞適合使用AAV作為載體進行外源基因的導入及功能研究。

腺相關病毒載體；綠色熒光蛋白；正常細胞；腫瘤細胞；感染效率

DOI∶ 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.07.001

[First-author’s address] Department of Hepatobiliary Surgery, The Second Artillery General Hospital of Chinense People's Liberation Army, Beijing 100088, China.

基因治療是指將外源正常靶基因導入到靶細胞中，以糾正或補償由于基因缺陷或異常導致的疾病，包括基因修正和基因置換，而基因載體的發展對基因治療起了重要的推動作用[1]。在眾多載體中，病毒載體因具有長期基因表達和較高的感染效率而廣泛應用于基因治療中，尤其是具有顯著優勢的腺病毒載體。

腺病毒載體是基因治療中應用最為廣泛的載體之一，在近期研制流行性埃博拉病毒疫苗中得到應用[2-3]。腺病毒載體以其較低的成本和本身所具有的特異性，使其成為高效的轉染工具[4]。腺相關病毒載體(adenovirus-associated vector，AAV)是在腺病毒研究的制備工作中，電鏡下發現的“病毒樣”顆粒[5]。AAV宿主細胞具有多樣性，如造血干細胞、神經細胞、上皮細胞及成肌細胞等。重組腺相關病毒載體(recombinant AAV，rAAV)具有非致病性、低免疫原性、特異性位點整合以及穩定表達目的基因等特性，使其在眾多病毒載體中脫穎而出成為其中的佼佼者[6-7]。

AAV都具有不同的衣殼，從而將其進行分類，且衣殼使得AAV的趨性和轉導特點各有不同[8-9]。本研究以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)為報告基因，利用熒光顯微鏡觀察其感染效率，比較腺相關病毒對各型細胞的感染效率，探討腺相關病毒對各類型細胞的親和力，進一步為腺相關病毒用于基因治療提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

①特級胎牛血清和DMEM培養基購于美國GIbco公司；②質粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；③脂質體Lipofectamine2000和轉染液opti-MEM均購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養及質粒

研究所用293人腎上皮細胞、Hacat人永生化表皮細胞、SMC7721肝癌細胞、HepG2肝癌細胞、PANC-1胰腺癌細胞、BGC823人胃癌細胞、SCG7901人胃癌細胞、A549人肺癌細胞、H1299人肺癌細胞、H322人非小細胞肺癌細胞、MCF-7乳腺癌細胞、Hela宮頸癌細胞、A875人黑色素瘤細胞、C6大鼠神經膠質瘤細胞、K562人白血病細胞以及SEM-M兒童B-細胞急性淋巴細胞白血病均購于北京協和醫學院細胞庫。細胞株用含有雙抗的10%的DMEM培養基培養；AAV-DJ、Helper及AAV-GFP購自美國Addgene公司；感受態細胞(DH5α)購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 質粒提取方法

取4 ml過夜培養的菌液，12 000 rpm離心1 min，吸除上清，加入250 μl溶液P1(已加入RNase A)，徹底懸浮細菌沉淀；加入250 μl溶液P2，充分裂解菌體；加入350 μl溶液P3，充分混勻，直至出現白色絮狀沉淀。12 000 rpm離心10 min，將上清液轉移到吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，離心棄廢液，加入600 μl漂洗液PW(已加入無水乙醇)，洗滌吸附柱2遍并干燥；向吸附膜的中間部位滴加100 μl洗脫緩沖液EB，收集質粒于-4 ℃存放。

1.4 病毒包裝方法

將293FT細胞接種于6孔板中，培養過夜。包裝質粒AAV-DJ、Helper和穿梭質粒AAV-EGFP-Control總量4 μg按1∶1∶1的比例加入到150 μl的OPTIMEM，并加入4 μl的PlusTMLipofectamine?LTX，另用150 μl的OPTI-MEM稀釋10 μl的Lipofectamine?LTX，將上述兩種液體混合后混勻，在室溫(25 ℃)靜置15 min后加入6孔板的293FT細胞中。轉染48 h后收集上清和細胞，反復凍融3次。10 000 rpm離心1 min，收集上清于-80 ℃存放。

1.5 感染與感染效率觀察

(1)將細胞鋪入48孔板中，加入培養基200 μl/孔，當24 h后細胞密度達到90%左右時，每孔加入病毒液100 μl；6 h后棄去病毒液的培養基，更換正常培養基。

(2)繼續培養細胞48 h左右，在熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白表達并拍照，隨機選取3個視野計數GFP細胞數目，計算其感染效率。

1.6 統計學方法

應用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，計量資料結果以均值±標準差(x-±s)表示，兩組之間的比較采用t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞株GFP感染效率觀察

使用熒光顯微鏡觀察GFP的表達，比較AAVGFP對各類細胞的感染效率，衡量AAV對細胞的不同感染效率(如圖1所示)。

圖1 AAV-GFP對正常細胞和腫瘤細胞的感染效率(10×10)

2.2 細胞株感染AAV-GFP效率統計學分析

隨機選取3個視野，每個視野觀察總數為500個細胞，計數表達GFP細胞的數目并計算感染效率，以293FT細胞為對照，分析AAV對各類細胞的感染效率，其細胞感染率比較，差異有統計學意義(見表1)。

3 討論

分析結果顯示，AAV-GFP對Hela和293FT細胞有很高的感染效率(＞80%)，對SMC7721、BGC823及Panc-1的感染效率較高(50%～79%)，對HepG2、A549、A875、C6以及MCF-7的感染效率一般(30%～49%)，對H322、H1299、Hacat及K562的感染效率較低(1%～30%)，對SCG7901和SEM基本無感染效率(＜1%)。

表1 各種細胞株感染AAV-GFP效率統計學分析(%)

腺病毒載體是基因治療中一種安全有效的工具[10]。Atchison等[11]于1965年在腺病毒的制備中發現“病毒樣”顆粒，并將其命名為腺相關病毒，并一直沿用至今。AAV以其低成本、高表達目的蛋白及安全性得到了研究者的青睞[12]。

在腺病毒載體介導的基因治療中轉染效率是關鍵[13]。本研究借助重組載體AAV-GFP包裝成病毒對細胞進行轉染后，直接在倒置顯微鏡下觀察GFP表達量，以獲得較為直觀的結果。Sieger等[14]在其研究中用AAV載體對Hacat細胞的轉染效率為8%，在Du等[15]所做的研究中AAV對HepG2的感染率為56.45%。另有研究顯示，乳腺癌細胞MCF-7的轉染效率為(41.52±3.16)%，K562的感染效率為(60±2)%[16-17]。

上述結果與本研究實驗基本一致，腺相關病毒對不同細胞的感染效率存在差別，可能的因素很多，首先腺相關病毒的血清型不同導致其對特定的血清型細胞的感染效率較高[18]。不同類型的細胞株其血清型也不同，因此病毒與細胞的親和性出現差別。除了對細胞的親和性外，感染復數(multiplicity of infection，MOI)也會對感染效率有影響。MOI是指感染時病毒與細胞的比值，較高的MOI濃度會增加細胞毒性，使得細胞增值率和分泌功能下降[15]。同時，轉染的時間也是影響轉染效率的重要因素[19]。Aslanidi等[20]還發現，替換AAV病毒載體衣殼上的絲氨酸殘基，尤其是改為纈氨酸時，轉染效率大為增加。

本研究結果表明，GFP重組腺相關病毒對正常細胞293FT感染效率最高，對腫瘤細胞Hela、SMC7721、BGC823、PANC-1、A549、A875、C6和MCF-7的感染效率也較高，這類細胞適合使用AAV作為載體進行外源基因的導入及功能研究。

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Study on transfection efficiency and expression of recombinant adeno-associated virus in kinds of cell lines

ZHOU Kun-ming, LI Feng-sheng, YU Qing-hua, et al
China Medical Equipment,2015,12(7)∶1-4.

Objective∶ To Study on transfection effection and expression of recombinant adenoassociated virus in kinds of cell lines. Methods∶ Packaging 293FT cells with the packaging plasmids AAV-DJ, Helper, and shuttle plasmids, AAV-GFP of recombined adeno-associated virus by liposome. Collect the solution of virus and infect 2 normal cells and 15 kinds of cancer cells. 24hours after infection, the efficacy of adenoviral transfered into kinds of cells was assessed by quantification of GFP-positive cells under an inverted fluorescence microscope. Count cells in 3 random sights under microscope. Results∶The efficiency of GFP recombinant adeno-associated virus is various in these kinds of cells. The highest efficiency shows in 293FT cells and Hela cells, 96.2% and 81.86%. Conversely the efficiency is approximately 0 in SCG, SEM-M, SP20 cells. Conclusion∶ Due to the high and relatively high transfection efficiency of the AAV-GFP in normal cells, 293FT, and cancer cells, Hela, SMC7721, BGC823, Panc-1, A549, A875, C6, MCF-7, it is available to do some genetic therapy researh using AAV as a vector.

Adeno-associated virus; Green fluorescent protein; Normal cells; Cancer cells; Transfection efficiency

1672-8270(2015)07-0001-04

R446.113

A

周昆明,男,(1987- ),碩士研究生。遼寧醫學院第二炮兵總醫院研究生培養基地，研究方向：肝膽胰外科學。

2015-04-14

國家自然基金科學部主任基金(31340051)“腺病毒Ad-pig3RRP-PIAS3對輻射誘導肺腺癌細胞轉移的抑制作用及其機制研究”；國家自然科學基金青年科學基金(81202151)“低劑量輻射對樹突狀細胞遷移能力的影響及其分子機制研究”；國家自然科學基金青年科學基金(81001216)“NOK激酶促進腫瘤細胞周期進程及提高腫瘤細胞輻射敏感性分子機制研究”；全軍醫學科技“十二五”科研項目(CWS12J082)“快速PCC-FISH方法作為輻射生物劑量計的研究”；中國疾病預防控制中心青年科研基金(2015A201)“利用負載lewis細胞的小鼠模型評價低劑量輻射對機體抗腫瘤免疫功能的影響”

①遼寧醫學院第二炮兵總醫院研究生培養基地 北京 100088

②第二炮兵總醫院 北京 100088

③解放軍第307醫院胸外科 北京 100071

④中國疾病預防控制中心輻射防護與核醫學安全所 輻射防護與核應急中國疾病預防控制中心重點實驗室 北京 100088

*通訊作者：gaoling@nirp.cn；lifs0624@163.com