生長期運(yùn)動干預(yù)對去卵巢小鼠晚年骨代謝生化指標(biāo)的影響

周 燕（上海大學(xué) 上海 200436）

生長期運(yùn)動干預(yù)對去卵巢小鼠晚年骨代謝生化指標(biāo)的影響

周 燕（上海大學(xué) 上海 200436）

目的：通過對小鼠生長期實(shí)施運(yùn)動干預(yù)，結(jié)束后去卵巢模擬婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，靜養(yǎng)至晚年，研究生長期運(yùn)動對去卵巢小鼠晚年骨代謝生化指標(biāo)的影響。方法：30只4周齡C57 BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為5組：A組，E組，S組，A+OVX組，E+OVX組，每組6只。E組和E+OVX組進(jìn)行下坡跑訓(xùn)練，每次40min，每周訓(xùn)練4次，共訓(xùn)練8周。訓(xùn)練結(jié)束后進(jìn)行第一次測試，A組和E組眼球摘除取血處死，分離血清，檢測血鈣、血磷濃度、血ALP活性。同時S組實(shí)行去卵巢假手術(shù)，A+OVX組和E+OVX組摘除卵巢。此三組小鼠靜養(yǎng)6周后處死，測試與第一次相同。結(jié)果：與A組相比，E組小鼠血鈣顯著降低，血磷、血ALP顯著增加；與A+OVX組相比，E+OVX組小鼠血鈣顯著降低，血磷、血ALP顯著增加。結(jié)論：生長期運(yùn)動干預(yù)可以通過影響血鈣、血磷、血ALP等特異性骨代謝生化標(biāo)志物，進(jìn)而用于評價全身的骨代謝水平，預(yù)測骨丟失、骨折等骨健康問題，以期為青少年時期進(jìn)行體育運(yùn)動預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供理論支持。

生長期 去卵巢小鼠 下坡跑 血鈣 血磷 血ALP

骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的，致使骨的脆性增加以及易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。Ι型骨質(zhì)疏松是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和伴隨的骨質(zhì)疏松性骨折，是發(fā)生最為普遍的一種骨質(zhì)疏松癥，嚴(yán)重危害世界各國的中老年婦女。

在骨質(zhì)疏松癥的形成和發(fā)展過程中，必然伴隨著骨代謝生化指標(biāo)的變化。骨代謝生化標(biāo)志物是指在骨代謝過程中與骨代謝有關(guān)的物質(zhì)及其產(chǎn)物，其變化先于骨量和骨微觀結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出來，往往能反映成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞受影響的狀況，以及骨基質(zhì)和骨礦物質(zhì)的變化。當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)外環(huán)境的影響時，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞就會分泌調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的生化標(biāo)志物，以調(diào)節(jié)骨的塑建和重建過程，進(jìn)而使骨量和骨微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。骨代謝生化標(biāo)志物在最近十年發(fā)展及其迅速，一些靈敏度高，特異性強(qiáng)的骨代謝生化標(biāo)志物已經(jīng)開始在骨質(zhì)疏松臨床上應(yīng)用，其中應(yīng)用最廣泛的就是血鈣、血磷和血清堿性磷酸酶(ALP)。而運(yùn)動可通過影響骨代謝生化標(biāo)志物的變化，進(jìn)而對骨質(zhì)疏松癥有積極的防治作用。因此，可通過對骨代謝標(biāo)志物的生化檢測來評定體育鍛煉效果。

1、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1、實(shí)驗(yàn)動物

雌性C57BL/6小鼠共30只，約4周齡，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，測量體重為16．23±1．36g，隨機(jī)分為5組，每組6只，安靜組（A）、運(yùn)動組（E）、假手術(shù)組（S）、安靜+去卵巢組（A+OVX）、運(yùn)動+去卵巢組（E+OVX）。

1.2、去卵巢手術(shù)

8周訓(xùn)練計(jì)劃結(jié)束后，A+OVX組和E+OVX組采用0．1g/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，在脊柱兩側(cè)切開背肌1cm的切口，摘除卵巢，S組小鼠進(jìn)行去卵巢假手術(shù)，僅去除卵巢周圍少量脂肪組織。

1.3、訓(xùn)練方案

E和E+OVX組小鼠從5周齡開始進(jìn)行跑速0．8km/h，坡度-9度的下坡跑訓(xùn)練，每次訓(xùn)練40分鐘，每周訓(xùn)練4次，共訓(xùn)練8周。A、A+OVX組和S組小鼠正常飼養(yǎng)，沒有安排訓(xùn)練。

1.4、取材

A組靜養(yǎng)8周和E組訓(xùn)練8周后，于E組小鼠最后一次訓(xùn)練結(jié)束24h后，進(jìn)行眼球摘除取血處死，進(jìn)行第一次指標(biāo)測試。血液用離心機(jī)5000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘分離出血清，采集出血清后，放入-80℃冰箱中保存，用于測定骨代謝生化指標(biāo)；S組、A+OVX組、E+OVX組手術(shù)后靜養(yǎng)6周后進(jìn)行第二次測量，方法等同于第一次。

1.5、指標(biāo)測定

利用血液指標(biāo)試劑盒和全自動酶標(biāo)儀測定血清中鈣、磷、堿性磷酸酶（ALP）。

（1）血鈣的測定原理和操作步驟（表1）

原理：血清Ca2+在堿性溶液中與甲基百里香酚藍(lán)（TMB）結(jié)合，生成藍(lán)色絡(luò)合物。通過比色與同樣處理的Ca標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，可計(jì)算出Ca的含量。

表1 血鈣的測定原理和操作步驟

混勻，靜置5分鐘后，波長610nm，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度。根據(jù)下列公式計(jì)算鈣含量：

（2）血磷的測定原理和操作步驟（表2）

原理：血清經(jīng)尿素溶解稀釋后，用孔雀綠—鉬酸試劑顯色，在一定范圍內(nèi)，顏色深度與含量成正比。

表2 血磷的測定原理和操作步驟

混勻，溫室準(zhǔn)確放置15分鐘，640nm比色，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測定各管吸光度。按照下列公式計(jì)算磷含量：

ALP的測定原理和操作步驟（表3）

原理：堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺測定酶活力的高低。

表3 ALP的測定原理和操作步驟

立即混勻，520nm，0．5cm或者1cm光徑比色，空白管調(diào)零，測各管吸光度。按照下列公式計(jì)算堿性磷酸酶的活力：

1.6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1、實(shí)驗(yàn)后各組小鼠骨代謝生化指標(biāo)的比較

2.1.1、實(shí)驗(yàn)后各組小鼠血鈣濃度的比較（表4）

從表4可以看出，下坡跑8周后，E組小鼠血鈣顯著低于A組小鼠（p＜0．05）

去卵巢6周靜養(yǎng)結(jié)束后，A+OVX組小鼠血鈣顯著高于S組小鼠（P＜0．05）。E+OVX組小鼠血鈣顯著低于與A+OVX組小鼠（P＜0．05）。

2.1.2、實(shí)驗(yàn)后各組小鼠血磷濃度的比較（表5）

從圖4可以看出，下坡跑8周后，E組小鼠血磷顯著高于A組小鼠（p＜0．05）。

去卵巢6周靜養(yǎng)結(jié)束后，A+OVX組小鼠血磷顯著低于S組小鼠（P＜0．05）。E+OVX組小鼠血磷顯著高于與A+OVX組小鼠（P＜0．05）。

2.1.3、實(shí)驗(yàn)后各組小鼠血清ALP活性的比較（表6）

從圖4可以看出，下坡跑8周后，E組小鼠血ALP顯著高于A組小鼠（p＜0．05）。

表4 下坡跑臺運(yùn)動對各組小鼠血鈣濃度的影響

表5 下坡跑臺運(yùn)動對各組小鼠血磷濃度的影響

表6 下坡跑臺運(yùn)動對各組小鼠血清ALP活性的影響

去卵巢6周靜養(yǎng)結(jié)束后，A+OVX組小鼠血ALP顯著高于S組小鼠（P＜0．05）。E+OVX組小鼠血ALP顯著高于與A+OVX組小鼠（P＜0．05）。

3、分析與討論

3.1、血鈣、血磷、血ALP與骨生成的關(guān)系

骨質(zhì)疏松的發(fā)生與骨形成和骨吸收調(diào)節(jié)失衡有關(guān)，其外在表現(xiàn)之一為骨礦物質(zhì)含量減少。骨礦物質(zhì)主要是鈣和磷混合物以及鈣磷羥基磷灰石晶體形成的。鈣是骨中一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)，是唯一的以儲存形式擔(dān)任重要功能的營養(yǎng)素。人體內(nèi)磷的含量居于第二，僅次于鈣，血液鈣和磷的濃度有密切關(guān)系，當(dāng)血鈣以鈣鹽形式沉淀時，血鈣減少，相應(yīng)血磷的濃度就會上升，血鈣和血磷的比例是固定的。由于骨細(xì)胞的活動，新骨不斷形成，鈣不斷被沉積到骨上，同時又不斷地從骨中釋放到血液循環(huán)中，所以血液中鈣和磷的含量可以作為反應(yīng)骨代謝的標(biāo)志性物質(zhì)。因此，通過測定血鈣和血磷的含量可間接了解骨代謝的狀況。

血清堿性磷酸酶(ALP)是最常用的評價骨形成的指標(biāo)。成骨細(xì)胞含有豐富的堿性磷酸酶，其在骨礦化區(qū)水解磷脂，釋放的磷酸根和鈣結(jié)合，沉淀在骨膠原架上，進(jìn)行骨礦化效應(yīng)。當(dāng)成骨細(xì)胞處于活躍狀態(tài)時，其分泌較多的ALP，一部分參與骨的礦化作用，還有一部分要釋放到血液中使血清ALP的活性升高。血清中約50%的ALP來源于骨，剩下一半由肝產(chǎn)生，只有極少量來源于小腸或者胎盤。研究發(fā)現(xiàn)血清ALP的活性越高，成骨細(xì)胞就越活躍，因此認(rèn)為成骨細(xì)胞促進(jìn)骨形成作用可以使血清ALP活性升高。臨床上發(fā)現(xiàn)采用成骨療法治療Ι型（絕經(jīng)后）骨質(zhì)疏松，患者血清ALP活性升高。

3.2、生長期運(yùn)動干預(yù)對去卵巢小鼠晚年骨代謝生化指標(biāo)的影響

骨礦物質(zhì)中的鈣與骨的關(guān)系最緊密，正常人99%的鈣存在于骨和牙齒中，鈣與磷共同形成骨鹽沉積。機(jī)體在進(jìn)行新陳代謝時，骨組織無時無刻地進(jìn)行著鈣、磷等代謝。同時在骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中伴隨著鈣和磷調(diào)節(jié)的失衡。許多研究顯示，適宜的運(yùn)動能改善血清鈣和磷的濃度，如章明放等研究證實(shí)，雌性大鼠進(jìn)行10周的跑步訓(xùn)練后，股骨中鈣的含量比安靜組大鼠提高了8．5%，血液中鈣的濃度顯著低于安靜組大鼠，而血磷、尿磷卻顯著增加；孟昭亨等對有訓(xùn)練習(xí)慣的老年男性，進(jìn)行血和尿中骨礦物質(zhì)生化指標(biāo)檢測，結(jié)果顯示運(yùn)動組的血鈣離子低于安靜組。

本實(shí)驗(yàn)8周訓(xùn)練結(jié)束后，E組血鈣比A組的降低，6周靜養(yǎng)結(jié)束后，A+OVX組與S組相比，血鈣顯著性下降，原因可能是由于去卵巢后雌激素迅速減少，而雌激素對骨代謝具有十分重要的作用，它能通過對降鈣素、甲狀旁腺素等的影響作用，發(fā)揮抑制骨鈣釋出的反應(yīng)。E+OVX組血鈣與A+OVX組相比也降低，說明運(yùn)動可以促進(jìn)鈣吸收、利用，提高鈣在骨上的沉積，對防治骨質(zhì)疏松具有積極的作用，同時這種效應(yīng)能夠延續(xù)到老年時期。磷在人體內(nèi)的含量僅次于鈣，血鈣和血磷濃度有密切關(guān)系，當(dāng)血鈣以鈣鹽形式沉淀時，血鈣減少，血磷的濃度會上升。本實(shí)驗(yàn)8周訓(xùn)練結(jié)束后，E組血磷比A組濃度要高，6周靜養(yǎng)結(jié)束后，E+OVX組血磷比A+OVX組增加，結(jié)果能與血鈣的變化進(jìn)行相互對照。

堿性磷酸酶(ALP)是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志，也是反映骨代謝的一項(xiàng)重要指標(biāo)。ALP能促進(jìn)骨組織對鈣、磷等礦物質(zhì)的吸收，增加骨量，提高骨密度。ATP活性還與機(jī)體雌激素含量有密切關(guān)系，所以可以比較準(zhǔn)確作為評價絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的指標(biāo)。吳國亭等研究發(fā)現(xiàn)大鼠去卵巢6個月后血清ALP、骨特異性ALP和髂骨的鎂元素均顯著降低。而運(yùn)動作為一種負(fù)荷刺激，對骨代謝會產(chǎn)生重要影響，提高ATP活性，如劉思金研究絕經(jīng)后女體育教師與非運(yùn)動老年女性骨密度和骨代謝生化標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，老年體育教師與非運(yùn)動老年人相比其血ALP明顯升高。

本研究結(jié)果顯示，8周運(yùn)動后，E組較A組的血清ALP活性明顯要高，其機(jī)理可能是由于運(yùn)動誘導(dǎo)成骨細(xì)胞數(shù)目的增多或者活性的提高，引起血液中ALP數(shù)目或者活性增加，從而提高骨轉(zhuǎn)化，促進(jìn)骨形成，提高骨健康。在去卵巢靜養(yǎng)6周后，與A+OVX組相比，E+OVX組小鼠血清中ALP活性明顯要高，說明生長期下坡跑對去卵巢后靜養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞的作用仍然存在，E+OVX組小鼠成骨細(xì)胞的功能仍高于A+OVX組，生長期運(yùn)動干預(yù)可以在一定程度上彌補(bǔ)由于雌激素缺乏對骨組織造成的影響。

4、結(jié)論

4.1、生長期運(yùn)動能顯著降低去卵巢小鼠血鈣，提高血磷，同時使血清堿性磷酸酶活性顯著性增加，并且早期運(yùn)動產(chǎn)生的效果將一直持續(xù)到婦女絕經(jīng)后。

4.2、為骨特異性生化指標(biāo)在骨質(zhì)疏松臨床上應(yīng)用及預(yù)防骨質(zhì)疏松，促進(jìn)骨健康提供理論依據(jù)。

[1]孟迅吾．骨質(zhì)疏松癥—我們面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[J]．國外醫(yī)學(xué)內(nèi)分泌學(xué)，2004，24(4)： 219-223．

[2]李梅，夏維波．骨質(zhì)疏松癥的診斷與鑒別診斷[J]．中國臨床醫(yī)生，2013，41(6)：5-7．

[3]Kim SW， Park DJ， Park KS，et al．Early changes in biochemical markers of bone turnover predict bone mineral density response to antiresorptive therapy in Korean postmenopausal women with osteoporosis[J]．Endocr J，2005，52：667-674．

[4]梁曉霞．上坡和下坡跑臺訓(xùn)練對去卵巢小鼠骨密度、骨代謝生化指標(biāo)及成骨相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響[D]．上海：華東師范大學(xué)，2011：1-53．

[5]周燕．早期運(yùn)動干預(yù)對去卵巢小鼠晚年骨組織形態(tài)及TGF-β1/ Smad3信號通路的影響[D]．上海：華東師范大學(xué)，2012：1-52．

[6]冼華，曹文富．血中骨代謝生化指標(biāo)在骨質(zhì)疏松癥診治中的意義[J]．中國骨質(zhì)疏松雜志，2007，13(1)：69-74．

[7]趙爽，劉源．鈣、磷攝入對骨代謝及骨組織形態(tài)影響的研究進(jìn)展[J]．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(3)：76-80．

[8]王世鵬．不同運(yùn)動方式對模擬失重后大鼠骨密度、骨代謝生化指標(biāo)和骨組織計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響[D]．上海：華東師范大學(xué)，2009：1-57．

[9]陳榮．生長期的下坡跑對去卵巢小鼠骨密度和破骨細(xì)胞分化的影響研究[D]．上海：華東師范大學(xué)，2012：1-54．

[10]戎贊華，竇志艷．徐青．骨形成的生化標(biāo)志物及其影響因素的研究進(jìn)展[J]．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003，12(2)：1319-1325．

[11]Dae Lim Koo，Kyoung Jin Hwang， Suk Won Han，et al．Effect of oxcarbazepine on bone mineral density and biochemical markers of bone metabolism in patients with epilepsy[J]．Epilepsy，2014，108(3)：442-447．

[12]章明放．運(yùn)動對此行大鼠去勢后骨質(zhì)疏松的作用—骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察[J]．中國骨科雜志，1994，14(6)：365-369．

[13]孟昭亨．老年長跑運(yùn)動員的骨代謝[J]．中華老年醫(yī)學(xué)雜志，1990，9(30)：161-164．

[14]耿紅梅，鄭陸，閻守扶．運(yùn)動-雌激素-骨代謝關(guān)系的研究進(jìn)展[J]．首都體育學(xué)院學(xué)報，2008，20(5)：57-61．

[15]卜淑敏，陳永杰，王穎捷．中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動對去卵巢大鼠骨量和相關(guān)血清性激素水平的影響[J]．中國老年學(xué)雜志，2011，30(3)：342-245．

[16]章曉霜．不同強(qiáng)度運(yùn)動對去卵巢大鼠血漿鈣磷水平的影響[J]．沈陽體育學(xué)院學(xué)報，2006，25(3)：63-65．

[17]Elisa A． Marques，Jorge Mota，Diana Tuna，et al．Response of bone mineral density，inflammatory cytokines，and biochemical bone markers to a 32-week combined loading exercise programme in older men and women[J]．Geromtology and Geriatrics，2013，57(2)：226-233．

[18]吳國亭，韓玉麒，于永春．去卵巢大鼠血清酶和骨元素鎂的關(guān)系[J]．同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2003，24(1)：8-10．

[19]劉思金，劉建剛，薛延．正常飲食中短期補(bǔ)充鈣劑對雙側(cè)卵巢切除大鼠骨質(zhì)量及骨代謝的影響[J]．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2004，14(2)：104-105．