KLKs基因表達對卵巢癌惡性度評估初探

曾照成，王曉玫

1.暨南大學第二臨床醫學院腫瘤內科，廣東深圳 518001；2.暨南大學第二臨床醫學院病理科，廣東深圳 518001

卵巢癌在婦科腫瘤中死亡率居首位，當前卵巢癌患病率呈逐年上升趨勢。由于卵巢癌的發病隱匿，所以找尋卵巢癌發病過程中的敏感及特異腫瘤標志物極有可能為為卵巢癌臨床診治和轉歸提供有價值的生物指標[1]。已有研究表明人類組織激膚釋放酶家族(Human kailikrein, KLK)于腫瘤發生發展多個過程中都有參與[2]，為研究激肽釋放酶（kallkarein)KLK10 及KLK11 在卵巢癌組織中的表達，現分析2008年1月— 2013年12月在該院行卵巢手術且資料完整患者75例的臨床資料，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年1月—2013年12月在暨南大學第二臨床深圳市人民醫院行卵巢手術且資料完整患者共75例為研究以對象，患者均為初次接受手術治療,術前未行放療、化療及其他藥物治療。

實驗分組:良性腫瘤組：卵巢良性上皮腫瘤組織32例，正常卵巢組織18例。卵巢癌組織43例。病理類型：在全部卵巢癌組中惡性腫瘤占43例，年齡40~70 歲。手術分期是：惡性腫瘤組別，Ⅰ期5例，Ⅱ期11例，Ⅲ期18例，Ⅳ期9例。

1.2 試劑和方法

KLK10，KLK11 兔抗人單克隆抗體購自美國RD 公司，二抗購自美國羅氏公司，DAB 購自美國羅氏公司。

采用免疫組化LDp 法，抗KLKn 的單抗工作濃度均為1:25。①常規切片脫蠟浸水，通過3%過氧化氫阻斷內源性組織過氧化物酶；②10 min 后室溫下進行高壓抗原修復；③HarriS 蘇木淡染精細胞核l min，洗片用流水，添加PBS 緩沖液；④加抗KLKll 單抗(工作濃度1:25)，4 ℃過夜；⑤第二日用PBS 緩沖液以沖洗切片3 次，5 min/次； ⑥加Envision TM 試劑,37 ℃孵 箱 內20 min；⑦PBS 沖洗3 次，5 min/次；⑧DAB/H2O2顯色，于光鏡下進行控制，純水對呈色反應進行終止；⑨常規脫水到封片。選擇已知的陽性組織切片作為陽性對照，以PBS 替代抗KLKn 單抗以作空白對照。

1.3 觀察指標

Klk10,11 免疫組化結果和Klk10,11 的定量表達情況。

1.4 評價指標

所有患者KLKll，KLK10 免疫組化的結果：如果在細胞胞核及胞質中出現棕黃色的反應物即判定為陽性表達。依據切片中的陽性細胞數及細胞陽性百分比將結果區分為:無表達(-):檢測切片當沒有陽性細胞;少量表達(+):檢測切片中陽性細胞<25%;一般表達(++):檢測切片中陽性細胞數≥25%、<50%;大量表達(+++):檢測切片中陽性細胞≥50%。

1.5 統計方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件對數據進行分析和處理，染色反應灰度值采用均數±標準差（±s）表示，兩組間的均數比較行t 檢驗，多個樣本間的均數行單因素方差分析，klk10,11 表達同卵巢癌的惡性程度評估分析使用χ2檢驗。

2 結果

2.1 Klk10,11 免疫組化結果

研究結果顯示：KLK11 都表達于健康卵巢、卵巢良性腫瘤、卵巢癌上皮組織細胞的胞質與胞核。但根據數據可以看出，卵巢癌組織中klk11 的表達明顯不如正常卵巢組織，差異有統計學意義（P<0.05）； 卵巢良性腫瘤組織中klk11 的表達與正常卵巢組織klk11 的表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組卵巢組織中klk11 的表達

由結果可以看出，Ⅰ/Ⅱ卵巢癌組織中的klk11 表達陽性率顯著高于Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌組織中的klk11 表達陽性率，結果差異有統計學意義（P<0.05）；G1 級卵巢癌組織中的klk11 表達陽性率和G2/G3 級卵巢癌組織中的klk11 表達陽性率差異無統計學意義（P>0.05）；不同組織學類型的卵巢癌組織中的klk11 表達陽性率存在著顯著差異，結果差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 卵巢癌組織中KLK11 表達與其臨床病理參數的關系

2.2 卵巢癌KLK10 與KLK11 表達定量分析

Klk11 于卵巢癌組織中的表達比它在正常的卵巢組織和良性的卵巢腫瘤組織表達的水平要低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1；Klk10 于卵巢癌組織中的表達比它在正常的卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織表達的水平要低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 各組卵巢組織中KLK10 的表達

3 討論

人類組織的激肽釋放酶基因(human tissue kallikreins gene，KLKs) 是一組高度保守的基因簇，在腫瘤組織中差異性表達。KLKs 的生物學功能主要通過其表達產物人類組織激肽釋放酶發揮作用[3]。

該研究應用免疫組化方法對KLK11、KLK10 于卵巢癌、卵巢的良性腫瘤和卵巢的正常組織當中表達情況進行研究。研究結果表明： ①KIKll 與KLK10 蛋白hKn 于卵巢上皮的細胞當中均有表達； ②KIKll 與KLK10 蛋白hKn 表達水平同卵巢細胞良惡性相關，它們于卵巢癌組織中的表達比在正常的卵巢組織和良性的卵巢腫瘤組織中表達要低 {KLK11 （P=0.044）KLK10 (P=0.002)}；③KLK11 與KLK10hKn 表達水平同卵巢癌臨床分期相，在最初卵巢癌組織中(Ⅰ/Ⅱ期)KLK11 和KLK10hKn 的表達水平明顯優于晚期的卵巢癌(Ⅲ/Ⅳ期){KLK11(P=0.010), KLK10(P=0.032)； ④KLKll 與KLK10hKn 的表達水平和卵巢癌組織學類型有關，KLKll 與KLK10hKll 在漿液性的卵巢癌組織中的表達與其他卵巢癌的組織類型相比有顯著升高(KLK11:P=0.003，KLK10:P=0.003)。這與已有的研究結果相類似[4]。

綜上所述，KLK10 和11 有望成為早期診斷卵巢癌的血清標志物，考慮到KLK 群的生物學特點，對它的檢測對于卵巢癌和其他類型播散性腫瘤的區分十分有益。

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