乳酸鹽通量及其控制分析：食品功能的定量化評(píng)價(jià)方法

李 陽，王興亞，王茜茜，龐廣昌

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

乳酸鹽通量及其控制分析：食品功能的定量化評(píng)價(jià)方法

李 陽，王興亞，王茜茜，龐廣昌*

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

目的：食品對(duì)機(jī)體的影響主要表現(xiàn)為對(duì)代謝和代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，本實(shí)驗(yàn)旨在研究食品對(duì)機(jī)體代謝作用的定量化評(píng)價(jià)方法。方法：通過對(duì)志愿者外周血采樣，首先研究4 種生理狀態(tài)（基礎(chǔ)狀態(tài)、學(xué)習(xí)狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和發(fā)燒狀態(tài)）下，乳酸鹽代謝通量的變化，同時(shí)研究中心代謝途徑中的15 種酶對(duì)乳酸鹽代謝通量的控制作用；采用相關(guān)分析和主成分分析相結(jié)合的方法，研究酶的表達(dá)（或合成）量對(duì)乳酸鹽代謝通量的作用，確定主成分及各種酶的控制系數(shù)。另招募健康志愿者，采集其食用大米變性淀粉前后的外周血樣，運(yùn)用已建立的代謝通量模型及控制分析方法對(duì)變性淀粉的功能性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：4 種狀態(tài)下乳酸鹽代謝通量各不相同，由小到大依次為：基礎(chǔ)狀態(tài)、學(xué)習(xí)狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和發(fā)燒狀態(tài)，4 種生理狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)的分解代謝依次增強(qiáng)，可見乳酸鹽代謝通量實(shí)質(zhì)上反映了機(jī)體分解代謝（氧化磷酸化供能）的強(qiáng)弱。丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK，CpPK=0.221 6），丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDHC，CpPDHC=0.206 4），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH，CpLDH=0.162 6），轉(zhuǎn)酮酶（transketolase，TKL，CpTKL=0.206 0）對(duì)乳酸鹽代謝通量起到主要作用，其中，PK的控制作用最強(qiáng)。志愿者食用變性淀粉后，乳酸鹽通量增強(qiáng)，分解代謝增強(qiáng)而合成代謝減弱；PK的基因表達(dá)（合成）量顯著增加（P=0.01＜0.05），PDHC的基因表達(dá)（合成）量極顯著降低（P=0.003＜0.01），說明所測(cè)酶的表達(dá)量與所預(yù)測(cè)的乳酸鹽通量之間的擬合程度較好。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立的評(píng)價(jià)方法可以通過采集適量的外周血對(duì)食用食品后的人體代謝作用進(jìn)行定量化評(píng)價(jià)。

功能性食品；評(píng)價(jià)方法；生理狀態(tài)；乳酸鹽代謝通量；代謝控制分析

20世紀(jì)80年代以來，人們的飲食消費(fèi) 結(jié)構(gòu)慢慢從“溫飽型”過渡為“小康型”，實(shí)現(xiàn)了從“食飽”、“食味”到“食療”方面的轉(zhuǎn)換，對(duì)食品有了越來越高的質(zhì)量追求，以滿足機(jī)體需要。人們致力于追求高營(yíng)養(yǎng)，但也正是由于吃精、吃細(xì)、營(yíng)養(yǎng)過剩以及營(yíng)養(yǎng)失調(diào)，致使機(jī)體代謝紊亂，肥胖癥、心腦血管疾病、糖尿病等“現(xiàn)代文明病”也因此發(fā)生，人們的健康受到了嚴(yán)重的威脅。為了調(diào)節(jié)人體生理活動(dòng)、增強(qiáng)體質(zhì)，防止疾病的發(fā)生，人們開始研究更具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食品——功能性食品。早在20世紀(jì)80年代，日本厚生勞動(dòng)省出臺(tái)的一項(xiàng)管理法規(guī)中就定義了功能性食品的概念[1]。在我國(guó)，功能性食品也被稱為保健食品[2]。

目前，市場(chǎng)上大量的功能性食品不斷涌現(xiàn)，從遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生理學(xué)以及細(xì)胞學(xué)等不同角度對(duì)功能性食品和其功能因子的生物學(xué)研究在國(guó)外比較普遍。如日本的XYZ評(píng)價(jià)系統(tǒng)、DNA芯片分析技術(shù)和建立應(yīng)用數(shù)據(jù)庫[3]。在我國(guó)，對(duì)功能性食品的生理作用評(píng)價(jià)主要是依靠動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)和人體試吃實(shí)驗(yàn)，但這些實(shí)驗(yàn)很難對(duì)功能性食品的作用機(jī)理進(jìn)行科學(xué)的、令人信服的解釋。尋找更好的、適用于人體的無損傷（或接近無損傷） 定量化評(píng)價(jià)方法已經(jīng)成為解決這些難題的關(guān)鍵所在。

乳酸鹽和乳酸這兩個(gè)名詞如今仍然被大多數(shù)人混淆，但二者實(shí)質(zhì)上是不同的，在生理pH值的條 件下，機(jī)體代謝產(chǎn)生的乳酸幾乎全部進(jìn)一步解離成為乳酸鹽和氫離子，以發(fā)揮生理作用[4-5]。乳酸并不只是一種簡(jiǎn)單的厭氧發(fā)酵產(chǎn)物，也不是造成機(jī)體“酸中毒”的罪魁禍?zhǔn)住Ｏ喾矗樗嶙鳛橐环N調(diào)節(jié)分子，具有整合和調(diào)節(jié)多條生理代謝途徑的作用[6]。乳酸在信號(hào)調(diào)節(jié)方面的作用體現(xiàn)在調(diào)節(jié)中心代謝途徑中酶的活性、調(diào)節(jié)炎癥和抗炎性細(xì)胞因子[7-8]等方面。盡管乳酸本身并沒有氧化還原作用，但它作為一種重要的代謝中間產(chǎn)物參與了糖酵解、生物合成和生物氧化等過程。研究表明，新陳代謝中的乳酸鹽代謝途徑對(duì)于運(yùn)動(dòng)后機(jī)體的生理反應(yīng)以及普遍疾病（如糖尿病和 癌癥）的發(fā)病機(jī)制具有重要作用[9-11]。肥胖和糖尿病與乳酸鹽代謝通量的改變有密切關(guān)系[12]。乳酸鹽通量的調(diào)控作用是通過中心代謝途徑中乳酸鹽合成途徑來實(shí)現(xiàn)的，維生素、微量元素，特別是許多微量元素實(shí)際上是酶的輔因子、輔酶、輔基等，這些微量元素都通過代謝網(wǎng)絡(luò)的整體調(diào)控發(fā)揮作用；另外，蛋白質(zhì)、脂肪以及各種功能性糖類的代謝都必須與中心代謝途徑相結(jié)合發(fā)揮整體的代謝網(wǎng)絡(luò)作用。在正常細(xì)胞中，乳酸鹽通量可以作為衡量分解代謝的重要指標(biāo)，即乳酸鹽通量增加，分解代謝作用增強(qiáng)[13]。生物體處于不同的生理狀態(tài)下具有不同的體溫水平，體溫對(duì)生物體的代謝又具有全面和協(xié)調(diào)的作用。在不同的生理狀態(tài)下，乳酸鹽通量明顯不同，受其代謝網(wǎng)絡(luò)中多種酶的調(diào)控，因此有必要探討哪些酶的合成量和活性對(duì)乳酸鹽通量的調(diào)節(jié)起到了關(guān)鍵作用。

近年來，抗性淀粉作為功能性食品或功能性成分添加到食品中，在控制血糖升高和緩解肥胖癥方面起到了保健作用。由于抗性淀粉在小腸內(nèi)不被吸收，因此不能為機(jī)體提供能源物質(zhì)，抗性淀粉主要在大腸內(nèi)菌群的作用下生成短鏈脂肪酸如乙酸、丁酸等，減緩結(jié)腸上皮萎縮或增加結(jié)腸中隱窩細(xì)胞的產(chǎn)率，提高結(jié)腸的健康程度，排除膽固醇酯，減少脂質(zhì)的吸收和脂肪的合成[19]。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織的報(bào)告中將RS3看成是膳食纖維的一部分，能夠影響胰島素水平和血糖生成指數(shù)[20]。這是因?yàn)镽S3在結(jié)腸中難以消化，可被用作為緩釋葡萄糖的載體，以控制體內(nèi)葡萄糖的釋放。目前，對(duì)于抗性淀粉的保健功能的評(píng)價(jià)，已有很多學(xué)者進(jìn)行研究，如分別對(duì)倉鼠或大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[21-24]，但是對(duì)于功能性食品來說，最終的食用群體是人類，因此，研究抗性淀粉在人體內(nèi)如何發(fā)揮保健作用，只需要采集志愿者少量外周血，便可從代謝角度對(duì)抗性淀粉的功能性進(jìn)行評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)選取變性淀粉中的RS3抗性淀粉為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，招募健康的青年志愿者，檢測(cè)其食用變性淀粉前后外周血清中各項(xiàng)指標(biāo)，建立代謝通量模型及控制分析方法，對(duì)變性淀粉的功能性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米變性淀粉 實(shí)驗(yàn)室自制。

丙酮酸、乳酸脫氫酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen，NADH）、磷酸烯醇丙酮酸、3-磷酸甘油酸、3-磷酸甘油醛、醛縮酶、6-磷酸果糖、1,6-二磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸甘油酸激酶、腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、腺苷一磷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH） 美國(guó)Sigma公司；Tris、羥乙基哌嗪乙硫磺酸、乙二胺四乙酸 美國(guó)Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

在實(shí)際情況中,由于頻譜泄漏的影響,Δφ通常不能嚴(yán)格等于零,所以只要Δφ小于一定閾值ε就可以認(rèn)為主瓣干擾不存在,否則判定主瓣干擾存在。本文通過對(duì)典型諧波信號(hào)的頻譜分析發(fā)現(xiàn),ε的合理取值為10-5。

3K15高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；HVE-50哈雅瑪高壓滅菌器 日本Hirayama Manufacturing公司；Fluoroskan Ascent FL熒光-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀 美國(guó)Thermo公司；PB-10 pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SBA-40C生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所；VIS-7220可見光分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；MINITEMP手掌型體溫測(cè)量計(jì) 美國(guó)Raytek公司。

1.3 方法

1.3.1 不同生理狀態(tài)下生理模型的建立

4 種生理狀態(tài)分別是：基礎(chǔ)代謝（睡眠）狀態(tài)、學(xué)習(xí)狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、發(fā)燒狀態(tài)。招募健康的青年志愿者（共8 人，其中每種生理狀態(tài)2 人，男女各半，女性志愿者未處于生理周期）。基礎(chǔ)代謝（睡眠）狀態(tài)模型的建立：安排志愿者入住校醫(yī)院，室溫適宜（20～25 ℃），第2天早晨將志愿者從睡眠中叫醒，不做任何活動(dòng)，排除一切肌肉活動(dòng)對(duì)測(cè)試的影響，每隔30 min測(cè)量一次體溫，采集一次血樣，共采集4 次；運(yùn)動(dòng)狀態(tài)模型的建立：充分休息后，志愿者在跑步機(jī)上進(jìn)行速率為8 km/h的被動(dòng)運(yùn)動(dòng)，每隔30 min測(cè)量一次體溫，采集一次血樣，共采集4 次；學(xué)習(xí)狀態(tài)模型的建立：充分休息后，志愿者按照要求的記憶任務(wù)，背誦一些資料，快速準(zhǔn)確并默寫出來，每隔30 min測(cè)量一次體溫，采集一次血樣，共采集4 次；發(fā)燒狀態(tài)模型的建立：招募發(fā)燒病人作為志愿者，每隔30 min測(cè)量一次體溫，采集一次血樣，共采集4 次。

選取變性淀粉中的RS3抗性淀粉為實(shí)驗(yàn)材料，招募健康的青年志愿者（共16 人，男女各半，女性志愿者均未處于生理周期）進(jìn)行2 d的實(shí)驗(yàn)。所有志愿者第1天食用無偏性基礎(chǔ)配餐作為空白對(duì)照，在食用后的2.5、3、3.5 h分別采集外周血；第2天在無偏性配餐的基礎(chǔ)上食用變性淀粉40 g，采血方法同第1天。運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)建立的代謝通量模型及控制分析的方法，從代謝的角度對(duì)變性淀粉的功能性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

將采集到的血液樣品，4 ℃、2 000 r/min離心10 min分離得到血清，將血清分裝并用液氮速凍，置于－80 ℃保存待測(cè)。

1.3.2 人代謝通量圖譜的建立

圖1 細(xì)胞內(nèi)中心代謝途徑網(wǎng)絡(luò)簡(jiǎn)化圖Fig.1 Central metabolic pathways for man

如圖1所示，根據(jù)生物化學(xué)[25]和代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建原則，構(gòu)建出人代謝網(wǎng)絡(luò)圖譜。該代謝網(wǎng)絡(luò)分布圖呈現(xiàn)了中心代謝途徑，將整個(gè)細(xì)胞代謝系統(tǒng)分為3 個(gè)子網(wǎng)絡(luò)：糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）、磷酸戊糖途徑。

1.3.3 代謝通量的計(jì)算

根據(jù)各節(jié)點(diǎn)處的代謝物的通量平衡關(guān)系，得到下式。

式中：G為m×n的化學(xué)計(jì)量系數(shù)矩陣；V為m維代謝反應(yīng)速率向量；dx/dt包含3 層含義：一是由實(shí)驗(yàn)測(cè)得底物消耗或產(chǎn)物合成的速率；二是生物合成前體物質(zhì)的合成速率；三是胞內(nèi)中間物質(zhì)，處于擬穩(wěn)態(tài)，累積速率為0[26]。

1.3.4 代謝物濃度及酶活性的測(cè)定

血清中葡萄糖、乳酸的含量，通過SBA-40C型生物傳感分析儀測(cè)定。NADH、NADPH的含量以及代謝網(wǎng)絡(luò)中的酶的合成量采用酶偶聯(lián)法，參考Pierce[27]和Teusink[28]等的方法，通過熒光化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得葡萄糖、乳酸及NADH含量變化后對(duì)時(shí)間微分，計(jì)算得出代謝速率。

1.3.5 不同生理狀態(tài)下體溫的測(cè)定

采用手掌型體溫測(cè)量計(jì)測(cè)量志愿者的體溫。

2 2 結(jié)果與分析

2.1 不同生理狀態(tài)下體溫測(cè)定結(jié)果

溫度的變化可以促進(jìn)某些植物更好地生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)果實(shí)的代謝過程、品質(zhì)及貯藏壽命；溫度還會(huì)影響動(dòng)物的新陳代謝活動(dòng)、生殖能力等。不論是恒溫動(dòng)物還是變溫動(dòng)物，都有特定的調(diào)節(jié)體溫方式。動(dòng)物大多通過調(diào)節(jié)體溫來適應(yīng)環(huán)境的變化以求生存。機(jī)體處于不同的生理狀態(tài)時(shí)，會(huì)自發(fā)地通過調(diào)節(jié)體溫來調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)酶的合成量，進(jìn)而調(diào)控自身代謝。如表1所示，人體處于不同的生理狀態(tài)下，體溫也會(huì)有所差異，與基礎(chǔ)狀態(tài)相比，學(xué)習(xí)、運(yùn)動(dòng)和發(fā)燒狀態(tài)均導(dǎo)致體溫升高，且呈遞增趨勢(shì)，說明機(jī)體進(jìn)行體力和腦力活動(dòng)引起體溫升高，進(jìn)而導(dǎo)致分解代謝增強(qiáng)。

表1 不同生理狀態(tài)下的體溫測(cè)量結(jié)果Table 1 Temperatures measured under different physiological states

2.2 乳酸鹽代謝通量測(cè)定結(jié)果

測(cè)定4 種生理狀態(tài)下采血樣品的血清中葡萄糖、乳酸及NADH的含量，用時(shí)間進(jìn)行微分得出代謝速率。根據(jù)1.3.3節(jié)所述方法，應(yīng)用Excel程序，計(jì)算得出4 種生理狀態(tài)下乳酸鹽代謝通量。

圖2 不同生理狀態(tài)的乳酸鹽通量Fig.2 Lactate fl ux under different physiological states

由圖2可知， 不同生理狀態(tài)下，乳酸鹽通量具有不同水平，起到了不同的生理作用。基礎(chǔ)狀態(tài)、學(xué)習(xí)狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和發(fā)燒狀態(tài)的乳酸鹽通量分別為－10.00±0.08、－3.07±0.14、42.11±0.04、58.97±0.12。說明4 種生理狀態(tài)的乳酸鹽通量依次增加，4 種生理狀態(tài)下機(jī)體分解代謝依次增強(qiáng)。從基礎(chǔ)狀態(tài)到發(fā)燒狀態(tài)，機(jī)體通過增強(qiáng)分解代謝以產(chǎn)生更多的能量供應(yīng)來滿足機(jī)體需要。氧氣充足時(shí)，機(jī)體通過有氧呼吸進(jìn)行氧化磷酸化來實(shí)現(xiàn)能量供應(yīng)；當(dāng)呼吸鏈和氧化磷酸化受限或處于低氧、缺氧等狀態(tài)時(shí)，丙酮酸則在乳酸脫氫酶的催化下生成乳酸，乳酸在這種情況下充當(dāng)還原力（NADH）庫或起到載體的作用，通過體液循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)狡渌醒醯牡胤竭M(jìn)行氧化分解或參與糖異生作用，以滿足機(jī)體對(duì)于能量的需求。

2.3 15 種酶的合成量及其與乳酸鹽代謝通量的相關(guān)性分析

對(duì)4 種生理狀態(tài)下血清中15 種酶的合成量分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示，并用SPSS 17.0軟件對(duì)15 種酶合成量與乳酸鹽代謝通量進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果如表3所示。由表3可知，4 種生理狀態(tài)下的15 種酶與代謝通量之間存在著不同程度的相關(guān)性，15 種酶之間也存在著相關(guān)關(guān)系，每一種酶都影響著乳酸鹽代謝通量，因?yàn)樗鼈冊(cè)谌樗岬暮铣纱x途徑中的作用存在著重疊性，這正是代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控特點(diǎn)。由于各種酶與代謝通量的關(guān)系十分復(fù)雜，所以更加深入地分析酶對(duì)乳酸鹽通量的控制作用，還需進(jìn)一步研究。

表2 4種生理狀態(tài)下的15 種酶的合成量Table 2 Expression levels of enzymes measured under different physiological conditions mol/（min·mg pro）

表3 各種酶合成量與乳酸鹽通量之間的相關(guān)系數(shù)Table 3 Person correlation coeffi cients between enzymes and lactate Table 3 Person correlation coeffi cients between enzymes and lactate metabolic fl ux l ux

2.4 基于主成分分析的代謝控制分析

表4 主成分載荷矩陣Table 4 Principal component matrix

如表4所示，通過主成分分析，得到方差分解主成分提取分析表，前2 個(gè)主成分解釋了全部方差的98.632%。說明這些數(shù)據(jù)代表15 種酶對(duì)乳酸鹽代謝通量的調(diào)節(jié)作用，沒有明顯的信息損失。因此提2 個(gè)主成分，主成分1的貢獻(xiàn)率達(dá)到了82.835%，主成分2的貢獻(xiàn)率為15.797%。其中主成分1主要反映了丙酮酸激酶（PK）、乳酸脫氫酶（LDH）、磷酸己糖異構(gòu)酶（GPI）、烯醇化酶（ENO）、α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物（α-KGDHC）對(duì)乳酸鹽通量的控制作用，這幾種酶主要集中在代謝網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)——丙酮酸（pyruvic acid，PYR）節(jié)點(diǎn)處，糖酵解過程中，PK催化磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）生成丙酮酸，丙酮酸再由LDH催化，生成乳酸，因此該節(jié)點(diǎn)處的流量分配直接影響乳酸鹽通量。主成分2主要反映了己糖激酶（HK）、醛縮酶（ALD）、磷酸甘油酸激酶（PGK）對(duì)乳酸鹽通量的控制作用，這幾種酶多為糖酵解途徑中的酶，間接影響乳酸鹽通量。

用表4中的數(shù)據(jù)計(jì)算2 個(gè)主成分中每個(gè)指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的系數(shù)，再以每個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的特征值占所提取主成分總的特征值之和的比例作為權(quán)重計(jì)算綜合主成分中每個(gè) 指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的系數(shù)。這組系數(shù)綜合反應(yīng)每種酶對(duì)代謝通量的控制作用的大小，將歸一化后的數(shù)值記為Cp。由表5可知，丙酮酸激酶（PK，CpPK=0.221 6），乳酸脫氫酶（LDH，CpLDH=0.162 6），轉(zhuǎn)酮酶（TKL，CpTKL=0.206 0），丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（PDHC，CpPDHC=0.206 4）對(duì)乳酸鹽代謝通量起到了主要控制作用，其中，丙酮酸激酶（PK）的控制作用最強(qiáng)；而磷酸甘油酸激酶（PGK，CpPGK=－0.134 1）和磷酸己糖異構(gòu)酶（GPI，CpGPI=0.146 9）對(duì)乳酸鹽代謝通量也具有重要的控制作用。已有研究表明，基于相關(guān)分析和主成分分析所建立的代謝控制系數(shù)與基于通徑分析所建立的代謝控制系數(shù)具有較高的一致性[29]。

表5 主成分表達(dá)式矩陣系數(shù)和基于主成分分析的控制系數(shù)Table 5 Principal component expression coeffi cient matrix and control coeffi cients based on principal component analysis

2.5 變性淀粉對(duì)于代謝控制的功能性評(píng)價(jià)

將所測(cè)葡萄糖、乳酸、NADH的含量以及中心代謝途徑中的主要酶的表達(dá)量運(yùn)用上述方法進(jìn)行分析，結(jié)果從兩個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。一是乳酸鹽通量的變化：與空白對(duì)照相比，食用變性淀粉后，乳酸鹽通量從－238.84增加到37.00，說明食用變性淀粉后體內(nèi)的分解代謝增強(qiáng)而合成代謝減弱；二是中心代謝途徑中酶的基因表達(dá)量的變化：食用變性淀粉后，3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-pho-sphate dehydrogenase，GAPDH）和丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（PDHC）基因表達(dá)量顯著降低，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）、丙酮酸激酶（PK）的基因表達(dá)量則顯著升高。

對(duì)乳酸鹽通量起主要控制作用的丙酮酸激酶（PK，CpPK=0.221 6），丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（PDHC，CpPDHC=0.206 4），乳酸脫氫酶（LDH，CpLDH= 0.162 6）和轉(zhuǎn)酮酶（TKL，CpTKL=0.206 0），都是丙酮酸節(jié)點(diǎn)處的相關(guān)酶，它們的變化會(huì)改變?nèi)樗猁}通量。在對(duì)變性淀粉功能性評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)中，丙酮酸激酶（PK）的基因表達(dá)（合成）量顯著增加（P=0.01＜0.05），表明糖酵解途徑中由磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸的反應(yīng)增強(qiáng)，而丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（PDHC）的基因表達(dá)（合成）量極顯著降低（P=0.003＜0.01）表明由丙酮酸生成乙酰輔酶A的反應(yīng)反而減弱，這也解釋了乳酸鹽通量增強(qiáng)的原因。這些變化共同說明了所測(cè)酶的表達(dá)量與所預(yù)測(cè)的乳酸鹽通量之間的擬合程度較好。

3 結(jié) 論

為了能夠?qū)崿F(xiàn)食品對(duì)機(jī)體代謝作用的定量化評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)志愿者外周血采樣，首先研究了基礎(chǔ)狀態(tài)、學(xué)習(xí)狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和發(fā)燒狀態(tài)下，乳酸鹽代謝通量的變化，同時(shí)研究了中心代謝途徑中的15 種酶對(duì)乳酸鹽代謝通量的控制作用。結(jié)果表明，基礎(chǔ)狀態(tài)、學(xué)習(xí)狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和發(fā)燒狀態(tài)下的乳酸鹽代謝通量各不相同，乳酸鹽代謝通量由小到大依次為：基礎(chǔ)狀態(tài)、學(xué)習(xí)狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和發(fā)燒狀態(tài)，4 種生理狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)的分解代謝依次增強(qiáng)。為防止多維變量之間相互作用所造成的影響，繼續(xù)運(yùn)用相關(guān)分析和主成分分析相結(jié)合的方法，提取2 個(gè)主成分，計(jì)算出各種酶對(duì)乳酸鹽代謝通量的控制系數(shù)分別為：丙酮酸激酶（PK，CpPK=0.221 6），乳酸脫氫酶（LDH，CpLDH=0.162 6），轉(zhuǎn)酮酶（TKL，CpTKL=0.206 0），丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（PDHC，CpPDHC=0.206 4），其中，PK的控制作用最強(qiáng)；而磷酸甘油酸激酶（PGK，CpPGK=－0.134 1）和磷酸己糖異構(gòu)酶（GPI，CpGPI=0.146 9）對(duì)乳酸鹽代謝通量也具有較大的控制作用，由此確定了對(duì)乳酸鹽代謝通量起主要調(diào)控作用的幾種關(guān)鍵酶，這幾種酶基因表達(dá)量的變化即反映了分解代謝強(qiáng)度的變化。

志愿者食用大米抗性淀粉前后的檢測(cè)結(jié)果表明：食用抗性淀粉后，乳酸鹽通量增強(qiáng)，分解代謝增強(qiáng)，合成代謝減弱。PK的基因表達(dá)（合成）量顯著增加（P=0.01＜0.05），表明糖酵解途徑中由 磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸的反應(yīng)增強(qiáng)，而PDHC的基因表達(dá)（合成）量極顯著降低（P=0.003＜0.01）則表明由丙酮酸生成乙酰輔酶A的反應(yīng)反而減弱，比較完美地解釋了乳酸鹽通量增強(qiáng)的原因。這些變化也共同說明了所測(cè)酶的表達(dá)量的變化與所預(yù)測(cè)的乳酸鹽通量的變化之間具有較好的相關(guān)性，能夠較好地定量化評(píng)價(jià)食品對(duì)機(jī)體代謝作用。

乳酸鹽通量定量化地反映了機(jī)體內(nèi)分解供能（氧化磷酸化）的強(qiáng)度，利用乳酸鹽代謝通量分析和控制分析的方法，通過采集少量外周血檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，計(jì)算出乳酸鹽通量的變化和中心代謝途徑中起主要控制作用的酶的表達(dá)量，若乳酸鹽代謝通量增加，說明該食品對(duì)于分解代謝發(fā)揮促進(jìn)作用，反之亦然。這種方法的建立，可用于定量化評(píng)價(jià)功能性食品對(duì)機(jī)體的代謝作用，對(duì)于科學(xué)膳食、控制體質(zhì)量和個(gè)性化營(yíng)養(yǎng)與健康的保持具有重要的指導(dǎo)意義。

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Lactate Metabolic Flux Analysis and Metabolic Control Analysis: Quantitative Evaluation Method of Functional Foods

LI Yang, WANG Xingya, WANG Xixi, PANG Guangchang*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

The effects of food on the body are mediated mainly through its influence on the metabolic and metabolic networks after being ingested and absorbed. This study aimed to develop a new experimental method to quantitatively evaluate the effects of food on metabolic and metabolic networks. Peripheral blood samples were collected from volunteers with four kinds of physiological states including basic state (or sleeping state), learning state, motion state and fever state, and their changes in lactate metabolic fl ux were studied as well as the role of 15 enzymes involved in the central metabolic pathways in controlling lactate metabolic fl ux. The results indicated that lactate metabolic fl ux in the four states were quite different, following the increasing order: basic, learning, motion and fever, which was consistent with that observed for the catabolism. A combination of correlation analysis and principal component analysis was used to determine the control coeffi cient of lactate metabolic fl ux. The results showed that pyruvate kinase (PK, CpPK= 0.221 6), pyruvate dehydrogenase complex (PDHC, CpPDHC= 0.206 4), lactate dehydrogenase (LDH, CpLDH= 0.162 6), transketolase (TKL, CpTKL= 0.206 0) played major roles in controlling lactate metabolic flux, among which, PK played the most important role. Peripheral blood samples collected from healthy volunteers before and after eating modified rice starch were then analyzed by applying the experimental methods mentioned above and the results indicated that lactate flux was obviously enhanced after eating modifi ed starch as compared with that before eating and as the same effect was observed on the catabolism.On the contrary, the anabolism decreased. PK gene expression was signifi cantly increased (P = 0.01) whereas PDHC gene expression (synthetic) was signifi cantly reduced (P = 0.003). The present study showed that the gene expression profi les of enzymes were fi tted with the predicted lactate fl ux well. These results have demonstrated that this method could be used to quantitatively evaluate the effects of food on metabolism by collecting appropriate peripheral blood samples after eating it.

functional foods; evaluation methodology; physiological states; lactate metabolic fl ux; metabolic control analysis

TS207.7

A

1002-6630（2015）01-0185-06

10.7506/spkx1002-6630-201501035

2014-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371773）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD29B07）

李陽（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榇x工程。E-mail：liyang1980ss@126.com

*通信作者：龐廣昌（1956—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称访庖吲c生物傳感器。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn