等電點沉淀法魚分離蛋白結構與功能變化研究進展

王 偉，劉俊榮，馬永生，吳 忠，田元勇

（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023）

等電點沉淀法魚分離蛋白結構與功能變化研究進展

王 偉，劉俊榮*，馬永生，吳 忠，田元勇

（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023）

以蛋白質分離提取為出發點，系統回顧了國內外有關分離蛋白特別是魚分離蛋白的研究現狀，闡述基于等電點絮凝沉淀原理的蛋白分離技術在食品蛋白配料中的重要性。集中探討了分離后蛋白質結構與性質的變化，現有研究均表明分離過程中蛋白質空間結構的變化與分離魚蛋白產物的食品功能特性具有相關性。因此研究魚分離蛋白的結構變化規律，對于通過調控以改善魚蛋白配料的食品功能特性有重要指導意義。

蛋白分離；食品蛋白配料；功能；魚蛋白

基于等電點絮凝沉淀原理的蛋白質分離技術廣泛應用于食品領域。該技術最早應用于植物蛋白的提取分離，如商品化的大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI），因其卓越的功能特性，作為食品蛋白配料已被廣泛應用于食品工業領域[1]。近年來，蛋白質分離技術也越來越多地用于開 發水產蛋白資源[2]。據中國漁業統計年鑒，2012年全國水產品總產量5 907.68萬 t[3]。從 開發功能性蛋白配料角度出發，針對蛋白成分的開發與利用是低值原料及水產加工副產物精深加工利用的有效途徑，也是目前我國水產品加工領域亟待解決的問題。

pH調節法是源于等電點絮凝沉淀原理有效分離魚蛋白的蛋白質分離技術[4]，其特有優勢在于可回收肌漿蛋白以提高蛋白質的回收率，能有效地去除中性脂肪等，且回收蛋白質的功能性較好[2]。這種技術的出現，在解決水產蛋白質分離提取、開發新型功能性魚蛋白食品配料等領域，具有十分廣泛的前景。而魚蛋白在分離過程中，由于受pH值、溫度、離子強度等因素影響，分子結構、空間構象及理化性質等會發生一系列的變化，這些變化對蛋白質的營養性、安全性以及功能特性等將產生影響，因此探討蛋白質結構與功能特性的關聯十分必要。本文針對國內外有關蛋白分離，特別是魚分離蛋白的研究情況做了系統回顧。

1 蛋白質分離技術與魚蛋白資源利用

1.1 蛋白質分離技術與功能性食品蛋白質配料

食品蛋白配料被廣泛應用于現代食品工業中，根據蛋白配料的不同功能特性，分別用于各類食品的生產制造。所謂等電點絮凝沉淀原理是根據蛋白質的兩性特點，在一定pH值條件下，其氨基酸殘基側鏈基團帶凈正電或凈負電荷，使得蛋白溶解。在蛋白質等電點（pI）時，蛋白質凈電荷為零，此時其溶解度最小，進而聚集沉淀[5]，基于這個原理可有效分離純化蛋白質。早在1952年，Anon[6]利用等電點法從豌豆、堅果及大豆等植物提取分離蛋白；1956年Bolley[7]發現并解決了早期植物分離蛋白的風味缺陷；1957年大豆分離蛋白實現了商業化[8]。隨著技術的不斷成熟，作為功能性食品配料大豆分離蛋白已廣泛應用于焙烤食品、糖果、肉類加工制品、仿肉制品及嬰幼兒配方奶粉等[9]。

早期關于魚肉分離蛋白的研究重在分離，忽視了分離產物的加工性能對功能性的影響。1959年Vogel等[10]以脂肪含量低于4%的魚為原料，經等電點沉淀回收得到分離魚蛋白，進一步進行真空干燥處理，蛋白質不可避免地發生了熱變性，因此親水性遭到破壞。同樣，1968年 Libenson等[11]先利用40～100 ℃的熱堿溶液對魚碎肉進行處理，脫除脂肪等非蛋白組分，再利用等電點法進一步分離提純，得到的分離蛋白也徹底喪失了持水性。直到20世紀90年代，魚分離蛋白的研究在過程條件控制與分離產物功能性方面才獲得極大的進展。1999年，Hultin等[4]采用在低溫偏離蛋白質等電點的酸（pH＜2.5）或堿（pH＞10.5）條件下使蛋白 質充分溶出，然后通過離心或過濾將 骨刺、皮和脂肪等不溶物去除，再將pH值調至蛋白質等電點（約5.2～5.5）進行沉淀回收，制備魚分離蛋白（fish protein isolate，FPI）。值得注意的是，整個提取分離過程是在低溫（4 ℃）下進行的，由此蛋白質變性程度小、且蛋白回收率較高。與早期相比，蛋白分離產物在功能特性方面表現出突出的優勢，可歸納為[12]：1）操作簡單高效，原料絞碎均質后即可直接進行溶解處理；2）有效去除骨刺、皮和脂類等雜質，由于脂質氧化帶來的風味和質地下降問題可得到有效控制；3）有效回收可溶性肌漿蛋白，顯著提高了蛋白質的回收率，如Kristinsson等[13]研究顯示，以斑點叉尾鮰為原料，pH調節法能將魚蛋白回收率由傳統魚糜水洗法的62%提高至70%～86%；4）分離得到的魚蛋白具有優良的功能特性。很多研究表明，分離魚蛋白的凝膠特性優于傳統魚糜[14-15]。

總而言之，等電點沉淀法分離魚蛋白技術在蛋白質回收及功能特性方面表現出巨大優勢，同時可彌補魚蛋白在功能性食品蛋白配料中的空缺。目前已成為國內外水產加工領域的熱點之一。

1.2 蛋白分離技術在魚蛋白領域中的研究進展

國外關于魚分離蛋白的研究眾多，針對海水魚已有系列報道。對鯔魚（Mugil cephalus）[16]、石首魚（Umbrina）[17]、石斑魚（Epinephelus adscensionis）[18]等白肉魚分離蛋白的回收率及功能特性研究顯示，相比水洗魚糜，酸溶蛋白的回收率高，堿溶蛋白的凝膠性更好，但太平洋牙鱈（Merluccius productus）[19]分離蛋白沒有水洗魚糜的凝膠性好。另外，Kim等[20]報道不同pH值對太平洋鱈魚（Gadus morhua）分離蛋白凝膠特性影響，發現在pH 11條件下溶解魚肉能獲得最佳的凝膠特性。可見不同品種、pH值條件對于分離蛋白產物的凝膠特性有重要影響。對沙丁魚（Sardina pilchardus）[21]、竹莢魚（Trachurus japonicus）、日本鯖魚[22]等紅肉魚分離蛋白的研究表明，與水洗魚糜相比，蛋白回收率高但凝膠性差。Undeland等[23]以鯡魚（Clupea harengus）為原料制備分離蛋白的研究結果卻相反，其堿溶蛋白具有優良的凝膠性。此外，Taskaya等[24]制備鰱魚分離蛋白的研究發現回收蛋白若不加功能性添加劑，凝膠性則較差。Foh等[25]報道發現羅非魚（Oreochromis niloticus）堿溶分離蛋白的乳化性、起泡性較好。

國內關于魚分離蛋白的研究報道日益增多。起初陳申如等[26]研究了酸溶提取鰱魚肌肉蛋白的最適條件；付湘晉等[27]發現等電點沉淀法提取鰱魚分離蛋白的保水性比水洗魚糜差，酸溶蛋白有較好的乳化性。傅潤澤等[28]優化了鰱魚肌肉蛋白分離條件，確定pH 2.5酸溶或pH 11.5～12.5范圍內堿溶處理，蛋白質回收率可達到89.5%～90.5%。劉俊榮等[29]制備了羅非魚分離蛋白，結果表明與中性漂洗相比，回收的分離蛋白具有較好的溶解和分離效果且堿溶回收蛋白的功能性優于酸溶處理。另外，還有對低值的南美白對蝦（Penaeus vannamei Boone）[30]、箭齒鰈（Atheresthes stomias）[31]、蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）外套膜[32]分離蛋白功能特性的研究報道。

從大量的研究報道可見國內外研究焦點主要集中在分離魚蛋白產物的凝膠特性及蛋白回收率兩個方面。結果表明蛋白回收率均提高但分離蛋白的凝膠特性各有差異，堿溶蛋白相比酸溶蛋白的凝膠特性好，但與水洗魚糜相比，不同因素對凝膠特性影響不同，目前對分離魚蛋白的凝膠機制尚不十分清楚。

2 分離魚蛋白結構變化與功能特性

2.1 分離過程中蛋白質結構變化的研究進展

魚蛋白分離產物的功能性是蛋白分離技術的研究價值所在。在分離處理過程中，蛋白質所發生的空間結構變化勢必影響到分離產物的功能特性。Choi等[33]對太平洋鱈魚（Gadus macrocephalus）的肌肉蛋白質分離機理做了研究，經分析發現其肌球蛋白重鏈和肌動蛋白在提取過程中發生了降解，表面疏水性和巰基含量分析表明二者均下降。另外針對巖魚（Sebastes fl avidus）[18]的研究發現，巖魚蛋白在分離過程中肌原纖維蛋白和肌漿蛋白均發生變性，表現為溶解性下降和熱吸收峰的消失；此外，巰基含量分析發現，與魚肉和水洗魚糜相比，堿溶處理所得分離蛋白的二硫鍵交聯程度最大，其凝膠特性的分析結果也驗證了這一點，表現出較高的破斷力和形變值。Rawdkuen等[34]針對羅非魚（Orechromis niloticus）的研究結果表明，酸溶提取分離蛋白的肌原纖維蛋白發生了部分降解。孫月娥等[35]研究發現酸提鰱魚蛋白的肌球蛋白重鏈明顯降解，肌動蛋白含量顯著降低。王瑛[36]對羅非魚肌球蛋白在pH值調節下結構和性質變化進行了報道，發現偏離等電點時，肌球蛋白的表面疏水性逐漸增大、巰基含量逐漸減小、色氨酸熒光強度減弱。這表明肌球蛋白疏水基團暴露、分子結構發生變化。可見，在分離提取過程中魚肉蛋白的組分及結構均會發生變化，而國內外關于分離后蛋白質的結構變化及其變化對分離蛋白產物功能特性影響的基礎研究較少。因此，有必要探討等電點沉淀法分離蛋白后蛋白結構與性質變化和蛋白質結構與功能特性的關系等基本理論。

2.2 肌球蛋白在分離過程中的變化

魚肉中的蛋白質根據溶解性的不同分為3 類：鹽溶性的肌原纖維蛋白、水溶性的肌漿蛋白和不溶性的肌基質蛋白。其中肌原纖維約占魚肉總蛋白質的65%～80%，而肌球蛋白是肌原纖維中最豐富的功能性蛋白質。肌球蛋白復雜的結構，特別是在其氨基端，肌球蛋白桿部折疊起來呈球狀結構，賦予了肌球蛋白纖維狀和球狀結構特征[37]。許多研究發現，肌球蛋白主要決定了肌肉組織的持水性、凝膠性、乳化性與發泡性等[38]。2003年，Kristinsson等[37]報道了大西洋鱈魚（Gadus morhua）肌球蛋白經pH值調節分離過程中的構象和結構變化。結果發現pH 2.5酸溶處理使蛋白展開，肌球蛋白桿部由于靜電斥力作用可能完全解離，但在pH 11堿溶條件下無解離。同時極端pH值下均導致肌球蛋白重鏈的球狀頭部組分有顯著的構象變化。當pH值調整至中性，肌球蛋白的重鏈球狀頭部發生重折疊，但并未恢復到其天然狀態，而球狀頭部區域不可逆的變化使得其暴露出更多的巰基，導致疏水性增強、結構穩定性較差。Mohan等[39]研究鯔魚肌球蛋白時也發現了類似的結果。鯔魚肌球蛋白頭部比桿狀尾部對酸堿更敏感。發生重折疊后，酸處理肌球蛋白的三級結構依然有部分保持解離狀態，堿處理肌球蛋白卻沒有類似結果。大量研究都將在這期間肌球蛋白的分子結構部分展開繼而發生重折疊的狀態，即蛋白質的三級結構被破壞，但仍然保持其類似天然的二級結構和致密性，稱之為熔球態（molten globule）[40-42]。在蛋白質去折疊和重折疊過程中，都存在這樣相似的中間構象，主要通過疏水相互作用保持穩定。下面具體探討下肌球蛋白二級結構和三級結構發生的變化。

2.2.1 肌球蛋白的二級結構在分離過程中的變化

蛋白質一般具有4 級結構，其高級結構主要靠共價鍵、氫鍵、靜電作用、疏水作用等維持。蛋白質特定的結構是其行使其功能的物質基礎，蛋白質的各種功能又是其結構的表現。從某種程度上說，蛋白質的二級結構、三級結構、四級結構比一級結構與功能的關系更大。肌球蛋白的二級結構主要是α-螺旋結構，兩條重鏈尾部折疊形成。目前測定蛋白質二級結構的方法常用的主要有圓二色譜 、紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）、拉曼光譜（Raman spectroscopy）和核磁共振，前3 種方法可以確定蛋白質二級結構的類型和相對含量，核磁共振的化學位移則可以確定二級結構在一級結構中的具體位置[43]。Kristinsson等[37]對大西洋鱈魚（Gadus morhua）肌球蛋白的研究就通過遠紫外圓二色譜分析得出：肌球蛋白經極端酸或堿處理其二級結構基本未發生變化，其桿部仍然為α-螺旋結構。尤其是與變性劑鹽酸胍處理的蛋白相比，經酸/堿處理的肌球蛋白二級結構沒有顯著性變化。Raghavan等[44]研究酸誘導鯰魚肌球蛋白發現，不同種類的酸處理肌球蛋白的二級結構沒有顯著性變化，但在肌球蛋白展開前添加NaCl其α-螺旋含量會顯著性增加，表明鹽可以阻礙肌球蛋白變性展開而起到保護作用。同樣，Raghavan等[45]研究堿誘導鯰魚肌球蛋白發現，NaOH處理的肌球蛋白的二級結構在不同pH值下沒有顯著性變化。

2.2.2 肌球蛋白的三級結構在分離過程中的變化

蛋白質的三級結構是多肽鏈在二級結構基礎上通過側鏈基團的相互作用進一步卷曲折疊，借助次級鍵維系使α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲等相互配置而形成的特定的構象。肌球蛋白的三級結構主要在于球狀頭部，在蛋白分離提取過程中球狀頭部會發生展開再折疊，這期間必然引起肌球蛋白的三級結構的變化。如Kristinsson等[37]研究鱈魚（Gadus morhua）肌球蛋白采用近紫外圓二色譜分析肌球蛋白的三級結構變化。結果表明極端酸（pH 2.5）處理和堿（pH 11）處理均使肌球蛋白的三級結構有顯著的變化，所有蛋白質顯然失去了其三級相互作用。這就可以解釋“熔球態”的形成。

蛋白基團微環境變化也可反映蛋白的三級結構變化，主要是蛋白內源生色基團（Trp、Tyr和Phe）由蛋白質內部的疏水區向親水環境暴露，在極性環境下由于溶劑的淬滅作用特征基團的熒光強度降低或增強，最大發射峰位紅移或藍移，這種變化可用來衡量蛋白質分子發生去折疊的程度，進而反映三級結構的變化。Kristinsson等[37]研究了鱈魚肌球蛋白微環境中色氨酸殘基的變化，結果表明在酸和堿展開時有顯著的熒光猝滅，但最大熒光波長并沒有移動。而鹽酸胍作用下的蛋白分子有更明顯的熒光猝滅，熒光波長有顯著紅移。相比之下更加說明經酸堿處理的肌球蛋白的三級結構發生了顯著的變化。Raghavan等[44]通過色氨酸熒光光譜研究加鹽順序對酸誘導鯰魚的肌球蛋白的影響，結果發現無鹽時肌球蛋白的色氨酸熒光強度下降最快，暴露出色氨酸殘基數目增多使蛋白展開變性程度增加。但在肌球蛋白展開前加鹽其表現出較高的熒光強度，說明暴露的色氨酸殘基較少進而減少了蛋白質展開的程度。同樣Raghavan等[45]對堿誘導鯰魚肌球蛋白的結構變化研究也表現出相似的結果，可見加鹽順序對蛋白的構象和結構有很大的影響。

肌球蛋白的三級結構主要依靠疏水相互作用力來維持。除了蛋白質自身內在因素外，蛋白質在分離過程中表面疏水性的強弱也反映了肌球蛋白三級結構的變性程度。目前常在蛋白質分子的特殊部位引入外源熒光，測定外源熒光物質的熒光進而分析蛋白質的疏水微環境。常用的熒光探針主要有ANS（8-苯胺基-1-萘磺酸）、PRODAN（N,N-二甲基-6-丙酰-2-萘胺）等。Raghavan等[45]使用PRODAN熒光探針研究加鹽順序對堿誘導肌球蛋白結構的影響，結果發現與對照組相比，肌球蛋白展開前加鹽的疏水性降低，重折疊后加鹽的疏水性升高。疏水性增大，溶解度減小，蛋白變性程度增大，展開前加鹽疏水性降低表明鹽可以阻礙肌球蛋白變性展開而起到保護作用。

2.3 肌漿蛋白在分離過程中的變化

肌漿蛋白質主要包括肌溶蛋白、肌紅蛋白、肌漿酶、肌粒蛋白、肌質網蛋白等，這些蛋白質溶于水或低離子強度的中性鹽溶液，是肉中最易提取的蛋白質。研究人員已證明動物源蛋白（卵清蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白）和一些酶（如溶菌酶）具有熔球態，進一步的研究還發現處于中間態的蛋白其乳化和起泡等功能性質均有改善[46-47]。Kim等[48]研究了在阿拉斯加狹鱈魚糜凝膠中添加石斑魚肌漿蛋白的影響。結果發現凝膠中加入2%肌漿蛋白，破斷力顯著增加，但其變形值略有下降，表明肌漿蛋白可以改善蛋白凝膠特性。

2.3.1 肌漿蛋白的二級結構在分離過程中的變化

蛋白在分離過程中某些氫鍵體系會發生變化，與此同時其側鏈基團如酪氨酸、色氨酸吲哚環、苯丙氨酸的單基取代苯基羥苯基環及C=O伸縮振動都有輕微變化。拉曼散射光譜和紅外吸收光譜均可得到振動光譜，兩種手段可提供互補信息。通過檢測蛋白質酰胺鍵吸收紅外輻射的頻率，即可利用振動光譜來估算蛋白質中二級結構的含量。尤其是酰胺Ⅰ帶（80%為C=O伸縮振動，1 650 cm－1附近）、Ⅱ帶（60% N—H彎曲振動，1 550 cm－1附近）和Ⅲ帶（40% C—N伸縮振動，30% N—H 彎 曲 振 動，1 300 cm－1附近）通常被用來研究蛋白質的二級結構。Tadpitchayangkoon等[49]采用傅里葉變換紅外-拉曼光譜分析研究了條紋鯰魚（Pangasius hypophthalmus）肌漿蛋白經酸堿處理過程中結構的變化。結果顯示肌漿蛋白經酸處理α-螺旋轉化為β-折疊，而堿處理卻對α-螺旋無影響。據推測，酸處理主要中斷氫鍵的重排導致β-折疊形成。蛋白質分子的聚合已被證實涉及分子間的反平行β-折疊結構的形成[50-51]。這表明酸誘導的蛋白質變性程度比堿誘導的高。

2.3.2 肌漿蛋白的三級結構在分離過程中的變化

針對肌漿蛋白三級結構研究的很少。Tadpitchayangkoon等[52]研究了條紋鯰魚（Pangasius hypophthalmus）肌漿蛋白在不同pH值處理下構象變化。其中分別使用ANS和PRODAN外源熒光探針測定肌漿蛋白在不同pH值處理的表面疏水性，結果發現極端酸性（pH 2～4）誘導肌漿蛋白的巰基氧化，導致蛋白聚集和表面疏水性下降；而在堿性pH值條件下肌漿蛋白結合外部熒光探針的能力增強，說明肌漿蛋白在堿性下暴露的疏水基團增多，增大蛋白質展開程度。

表1 不同品種的魚蛋白經等電點沉淀法分離后結構變化的研究回顧Table 1 Overview on conformational changes of proteins from different fi sh species induced by acid and alkaline protein isolation

綜上所述，如表1，無論是酸溶還是堿溶，均會導致肌肉蛋白空間結構發生變化而后在等電點沉淀發生重折疊。這些變化影響蛋白質表面界面活性和巰基含量等。因此，研究提取分離中蛋白質的結構變化規律，對于通過調控蛋白質結構變化機制來改善分離魚蛋白功能特性有重要意義。

3 結 語

雖然基于等電點絮凝沉淀原理的蛋白質分離技術經過十余年的發展，在魚蛋白利用領域取得了較快的發展，但是還存在一系列的科學瓶頸問題有待進一步探索。目前國內外研究主要集中于分離魚蛋白提取和功能特性的表征，對魚蛋白在分離過程中結構的變化研究還較少，且結論各異。而且如前所述，研究的魚類品種還較少，因此很難找到魚蛋白在分離過程中結構的變化規律及其作用機理。因此，我們需要從魚蛋白分子空間結構變化規律出發，在表征魚蛋白的功能特性前提下，進一步研究蛋白質結構的變化規律以及其與功能特性的相互關系。

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Advances in Research on Structural and Functional Variation of Fish Protein Isolate Extracted by Isoelectric Precipitation

WANG Wei, LIU Junrong*, MA Yongsheng, WU Zhong, TIAN Yuanyong
(College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

The current status of studies on the extraction and processing of isolated proteins is reviewed systematically with emphasis on fi sh protein isolate. Various food protein ingredients extracted from different raw materials based on isoelectric precipitation method are discussed with particular emphasis on the development and utilization of fi sh protein. The present analysis is focused on the conform ation and structure of the protein molecules during isolation. Research has shown that large changes in conformation and structure are always accompanied by signifi cant changes in functional properties of the protein isolates. Therefore, it is essential to explore the mechanism of protein molecular structure during isolation in order to r egulate specifi c functional properties of the fi sh protein ingredients.

protein isolation; food protein ingredients; functional properties; fi sh protein

TS254.1

A

1002-6630（2015）01-0250-06

10.7506/spkx1002-6630-201501048

2014-03-01

國家自然科學基金面上項目（31271980）

王偉（1989—），女，碩士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：wangwei889331@163.com

*通信作者：劉俊榮（1963—），女，教授，博士，研究方向為水產品加工與質量安全。E-mail：ljunrong@dlou.edu.cn