大豆過氧化氫酶的分離純化及性質研究

方 玲，孫才云，唐云明

（西南大學生命科學學院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715）

大豆過氧化氫酶的分離純化及性質研究

方 玲，孫才云，唐云明*

（西南大學生命科學學院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715）

新鮮大豆芽經勻漿、磷酸緩沖液抽提、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析、Superdex-200凝膠過濾層析，獲得電泳純的過氧化氫酶。該酶酶活回收率為30.92%，純化倍數為293.09，酶比活力達到26 322.43 U/mg。該酶全分子質量為234.9 kD，亞基分子質量為57.42 kD；最適pH值為7.2，最適溫度為30 ℃，在pH 4.0～10.6及25～35 ℃范圍內有較好的穩定性；在30 ℃、pH 7.2條件下測得該酶對過氧化氫的Km值為31.82 mmol/L；十二烷基硫酸鈉、草酸、Ag+、Cu2+對該酶有強烈的抑制作用，Pb2+對該酶有雙重作用，低濃度時有激活作用而高濃度時抑制酶活性。

大豆；過氧化氫酶；分離純化；性質

過氧化氫酶（catalase，CAT；EC 1.1 1.1.6）又稱觸酶，是一類廣泛存在于動植物及需氧微生物體內的末端氧化還原酶，主要功能是催化過氧化氫發生歧化反應生成水和氧氣，清除體內的過氧化氫，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害[1]。其酶促活性為機體提供了抗氧化防御機理，是生物防御體系的關鍵酶之一[2]。它在農業、醫藥、食品加工、紡織、印染、環保等方面有十分重要的應用價值[3-10]。因此，獲得來源廣泛且成本低廉的CAT在理論和實踐方面有十分重要的意義。大豆（Glycine max），別名黃豆，一年生草本植物，起源于我國，至今已有5 000 年的種植史，具有美容養顏、抗癌、增強人體組織機能等作用[11-12]。大豆來源廣泛，成本低廉，四季均可取材，經實驗發現大豆中CAT含量十分豐富，且從大豆中分離純化CAT還未見報道，故本實驗嘗試以大豆為材料從中分離純化CAT，并對部分酶學性質進行研究，旨在為該酶更深入研究、開發及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以新鮮大豆芽為材料，購自重慶市北碚區永輝超市。

DEAE-Sepharose、Superdex-200、凝膠過濾層析分子質量標準品、蛋白質SDS-PAGE標準品 美國GE Healthcare公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；三羥甲基氨基甲烷、考馬斯亮藍R-250美國Bio-Rad公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

精密電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；PHS-32W微電路pH計 上海理達儀器廠；Mill-Q plus超純水儀美國Millipore公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀公司；蛋白核酸定量儀 日本島津公司；蛋白質純化系統 美國GE Healthcare公司；垂直板電泳槽和電泳儀 美國Bio-Rad公司；MC4L冷凍干燥機 德國Uni Equip公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆CAT粗酶液的制備

取新鮮的大豆芽的子葉部分30 g，用蒸餾水洗凈，按1∶15的比例加入預冷的磷酸鹽緩沖液（0.0 5 mol/L、pH 7.2、含1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）），勻漿后放于4 ℃冰箱中靜置抽提2 h后，紗布過濾，將濾液離 心40 min（4 ℃，12 000 r/min）， 收集上清液即為粗酶液。

1.3.2 硫酸銨分級鹽析

于粗酶液中加入硫酸銨粉末至30%飽和度，4 ℃靜置鹽析2 h，10 000 r/min離心0.5 h，收集上清液；再向其中加入硫酸銨粉末至40%飽和度，4 ℃靜置鹽析2 h，6 000 r/min離心0.5 h，收集沉淀，沉淀用抽提緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.2，含1 mmol/L EDTA）溶解，4 ℃條件下用0.25 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2，含1 mmol/L EDTA）透析12 h后即為初酶液。

1.3.3 DEAE-Sepharose離子交換層析

先用 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0，含1 mmol/L EDTA）平衡DEAE-Sepha rose離子交換層析柱后，取初酶液10 mL上柱，用0～0.5 mol/L的NaCl溶液（含0.05 mol/L，pH 8.0的磷酸緩沖液，1 mmol/L的EDTA）進行線性梯度洗脫，流速0.65 mL/min，每管收集6.5 mL；測定各管CAT活性和蛋白含量，收集活性較高的各管酶液，于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.4 Superdex-200凝膠過濾層析

先用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0，含1 mmol/L EDTA）平衡Superdex-200層析柱后，取在1.3.3節中收集的活力較高的CAT酶液4 mL上柱，用0.05 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液（含1 mmol/L的EDTA）洗脫，流速0.3 mL/min，每管收集10 min；測定各管CAT活性和蛋白含量；收集活性較高的酶液，4 ℃超純水透析脫鹽12 h，冷凍干燥后于－20 ℃冰箱保存備用。

1.3.5 CAT活力的測定

以H2O2為底物，采用鉬酸銨終止法[13]進行測定。酶活力單位定義為：在測定條件下，每分鐘催化分解1 μmol H2O2所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.6 CAT純度鑒定與分子質量測定[14]

用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對大豆CAT進行純度鑒定，采用質量分數為12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣量8 μL。該酶亞基分子質量用SDS-PAGE測定，全分子質量用Superdex-200凝膠過濾層析測定。

1.3.7 蛋白質含量的測定

用Bradford染料法與紫外分光光度法進行測定[14]。

1.3.8 大豆CAT部分性質研究

1.3.8.1 CAT最適pH值及pH值穩定性

用不同pH值（3.0～10.6）的緩沖液配制底物過氧化氫溶液，在37 ℃條件下，測定CAT在pH 3.0～10.6反應底物中的酶活力，每組實驗重復3 次，取平均值（以下實驗重復次數相同）。以酶活力最高值為100%，計算相對酶活力，以研究CAT最適pH值。將酶液置于不同pH值（3.0～10.6）的緩沖溶液中，室溫放置90 min后，測定CAT酶活力，以酶活力最高值為100%，計算該酶在不同pH值條件下的相對酶活力，研究該酶的pH值穩定性。

1.3.8.2 CAT最適溫度和熱穩定性

測定CAT在不同溫度（15～75 ℃），pH 7.2條件下的酶活力，以酶活力最高值為100%，計算相對酶活力，以研究CAT最適反應溫度。將酶液分別置于不同溫度（25～65 ℃）下保溫不同時間（1～5 h）后，在pH 7.2、37 ℃條件下測定其酶活力，以酶液不保溫時的酶活力為100%，計算其相對酶活力，以研究CAT的熱穩定性。

1.3.8.3 CAT米氏常數（Km）的測定

在最適條件下（30 ℃、pH 7.2），測定大豆CAT以不同濃度的過氧化氫（5、10、20、30、40、50 mmol/L）為底物時的酶活力，采用雙倒數法（Lineweaver-Burk法）[15]，計算出該酶的Km值。

1.3.8.4 不同化合物對CAT活 性的影響

分別將不同化合物配成200 mmol/L母液，按一定比例與磷酸鹽抽提緩沖液和酶液混合，使得各化合物終濃度分別為5、10、15、20、25、30 mmol/L，在4 ℃條件下作用30 min后，測酶活力，以不加化合物時的酶活力為100%，計算CAT的相對酶活力。

1.3.8.5 不同有機溶劑對CAT活性的影響

分別將甲醇、乙醇、異丙醇按一定比例與磷酸鹽抽提緩沖液和酶液混合，使得各有機溶劑終體積分數分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%，在4 ℃條件下作用30 min后，測酶活力，以不加有機物時的酶活力為100%，計算CAT的相對酶活力。

1.3.8.6 金屬離子對CAT活性的影響

分別將不同金屬離子（K+、Mn2+、Co2+、Mg2+、Pb2+、Ca2+、Li+、Ba2+、Cd2+、Cu2+、Ag+）配成50 mmol/L母液，按一定比例與磷酸鹽抽提緩沖液和酶液混合，使得各金屬離子的終濃度分別為1、2、3、4、5 mmol/L，在4 ℃條件下作用30 min后，測酶活力，以不加金屬離子時的酶活力為100%，計算CAT的相對酶活力。

2 結果與分析

2.1 大豆CAT的分離純 化

圖1 大豆CAT的DEAE-Sepharose離子交換層析Fig.1 DEAE-sepharoseion-exchange chromatography profi le of crude CAT solution

圖2 大豆CAT的Superdex-200凝膠過濾層析Fig.2 Superdex-200 gel fi ltration chromatography of catalase from Glycine max

表1 大豆CAT的分離純化Table 1 Summary of isolation and purifi cation of catalase from soybean

大豆CAT的初酶液經DEAE-Sepharose離子交換層析的結果如圖1所示，酶活性主要集中在18～22 管，收集酶活性較高管的洗脫液直接用于凝膠層析，經Superdex-200凝膠層析后的洗脫圖譜如圖2所示，酶活性主要集中在37～41 管，收集酶活性較高管的酶液，蒸餾水透析、冷凍干燥后，經SDS-PAGE電泳，顯示為單一條帶（圖3），說明該酶經過分離純化后已達到了電泳純。酶的整個分離純化結果如表1所示，最終得到大豆CAT的回收率為30.92%，酶比活力為26 322.43 U/mg，純化倍數為293.09。

2.2 大豆CAT的分子質量

圖3 大豆CAT的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of purified catalase from soybean

純化后的CAT用SDS-PAGE電泳分析為單一條帶（圖3），測得大豆CAT的亞基分子質量為57.42 kD用Superdex-200凝膠過濾層析測得全酶的分子質量為234.9 kD（圖4），由此可以推斷該酶由4 個相同的亞基組成。

圖4 Superdex-200凝膠過濾層析測大豆CAT的分子質量Fig.4 Molecular weight estimation of catalase by Superdex-200 gel fi ltration chromatography

2.3 大豆CAT的最適溫度與熱穩定性

圖5 溫度對大豆CAT酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on CAT activity

由圖5可知，大豆CAT的最適溫度為30 ℃。該酶在25～35 ℃范圍內有相當好的熱穩定性，保溫5 h相對酶活力在86%以上，45 ℃時保溫5 h相對酶活 力仍在50%以上，超過此溫度相對酶活力迅速下降，65 ℃時保溫1 h，酶活力幾乎完全喪失（圖6）。可能是因為高溫破壞了酶分子的天然三維空間結構使酶的催化功能發生改變。

圖6 大豆CAT的熱穩定性Fig.6 Thermal stability of CAT

2.4 大豆CAT的最適pH值與pH值穩定性

圖7 pH值對大豆CAT酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on catalase activity

圖8 大豆CAT的pH值穩定性Fig.8 pH stability of catalase activity

由圖7可知，大豆CAT的最適pH值為7.2。由圖8可知，該酶在pH 4.0～10.6范圍內穩定性較好，室溫放置90 min，相對酶活力均保持在75%以上，說明該酶對酸堿的耐受范圍較廣，有非常好的應用價值。

2.5 米氏常數（Km）的測定結果

由實驗結果可知，在30 ℃，pH 7.2條件下分別測定以不同濃度（5、10、20、30、40、50 mmol/L）為底物時該酶的反應速率，按Lineweaver-Burk作圖法，計算出大豆CAT的Km值為31.82 μmol/L（圖9）。該酶Km值為31.82 μmol/L，與蘆薈[13]（34 mmol/L）、蒜苗[16]（38.2 mmol/L）、鴨肝[17]（37.29 mmol/L）的Km值相接近，而遠高于蘋果[18]（2.27 mmol/L）、重組大腸桿菌[19]（7.75 mmol/L）、發芽的黑綠豆（16.2 mmol/L）[20]的Km值，也遠低于韭菜[20]（46.93 mmol/L）、大鼠肝臟[21]（56 mmol/L）、氧化葡糖桿菌[22]（61 mmol/L）的Km值，說明不同來源的CAT對底物的親和力有差異。

圖9 雙倒數法測得大豆CAT的米氏常數曲線Fig.9 Lineweaver-Burk plot for Kmdetermination of CAT

2.6 不同有機溶劑對大豆CAT活性的影響

圖10 甲醇、乙醇、異丙醇對大豆CAT酶活力的影響Fig.10 Effect of methanol. ethanol and isopropyl alcohol on CAT activity

由圖10可知，3種有機溶劑對大豆CAT都有抑制作用，當有機溶劑體積分數在10%～30%范圍時，該酶的相對酶活性變化趨勢不大，超出此范圍，有機溶劑體積分數越大，抑制作用就越大，可能是因為有機溶劑的加入使酶周圍的水化層被破壞，導致由水分子直接或間接參與形成的氫鍵、疏水鍵及范德華力已被破壞，從而引起酶構象發生改變，使酶活性下降[23]。

2.7 不同化合物對大豆CAT活性的影響

圖11 不同化合物對大豆CAT的酶活力的影響Fig.11 Effect of various compounds on CAT activity

由圖11可知，SDS對該酶活性的抑制作用最強，當濃度達到5 mmol/L時，酶活性完全喪失，可能是因為SDS是一種陰離子去污劑能夠破壞酶蛋白分子中的氫鍵和疏水鍵，改變酶的空間構象，使酶活性降低[23]。草酸對該酶活性也有較強的抑制作用，當濃度達到20 mmol/L時，酶幾乎完全失活。而脲素、EDTA對該酶活性影響不大，當濃度達到30 mmol/L時，相對酶活力均在85%以上。

2.8 金屬離子對大豆CAT活性的影響

圖12 不同金屬離子對大豆CAT酶活力的影響Fig.12 Effect of metal ions on CAT activity

由圖12可知，Cu2+、Ag+對大豆CAT的抑制作用最強，當濃度在1 mmol/L時，該酶的相對酶活力為0。Li+、Mn2+、Mg2+、K+對該酶活性的抑制作用相對較弱，而Ba2+、Cd2+、Co2+、Ca2+對該酶的抑制作用較明顯。Pb2+在低濃度（≤3 mmol/L）時對該酶活性有激活作用，高濃度（＞3 mmol/L）時對該酶活性有抑制作用。

3 討 論

本實驗以來源廣泛、成本低廉、四季均可取材的大豆子葉為實驗材料，經勻漿、磷酸緩沖液抽提、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析及Superdex-200凝膠過濾層析，從大豆子葉中分離純化出了CAT的均一組分。用pH 7.2磷酸鹽緩沖液平衡DEAE-Sepharose離子交換柱時，目的蛋白沒有被該離子柱所吸附，通過實驗發現，用pH 8.0的磷酸鹽緩沖液平衡柱子，目的蛋白能有效地吸附在離子柱上，與雜蛋白分離效果較好，且收集到的樣品酶活較高，無需濃縮可直接上Superdex-200凝膠過濾層析柱，減少實驗步驟的同時減少了酶活損失，同時得到了電泳純的大豆CAT；雖然酶活回收率低于蒜苗CAT[17]（蒜苗CAT的回收率40.05%），但比活力和純化倍數高于蒜苗CAT[17]（蒜苗CAT的比活力為25 975.36 U/mg，純化倍數為125.97）。

該酶最適反應溫度為30 ℃，與火龍果[27]（30 ℃）的最適溫度一致，而低于其他來源的CAT的最適溫度，該酶在25～35 ℃范圍內有相當好的熱穩定性，保溫5 h相對酶活力在86%以上，45 ℃時保溫5 h相對酶活仍在50%以上；該酶在pH 4.0～10.6范圍內穩定性較好，室溫放置90 min，相對酶活力均保持在75%以上，說明該酶對酸堿的耐受范圍較廣，有非常好的應用價值，最適pH值為7.2，與韭菜[21]（7.2）、蒜苗[16]（7.2）的最適pH值相一致，而與鴨肝[17]（7.0）、貽貝[26]（7.0）、大鼠[22]（7.5）、火龍果[27]（7.0）、蘆薈[13]（7.5）的最適pH值近似，說明不同來源的CAT對環境中的pH值有相似的適應性。

該酶亞基分子質量為5 7.4 2 k D，與鴨肝[17]（6 2.5 k D）、蒜苗[16]（5 9.1 6 k D）、韭菜[21]（62.34 kD）、蘆薈[13]（60.60 kD）的亞基分子質量相接近，而與貽貝[26]（76 kD）的CAT的亞基分子質量有差異，說明不同來源的CAT在分子結構上具有物種特異性。

通過實驗表明：Cu2+、Ag+對該酶有強烈的抑制作用，濃度為1 mmol/L時酶活完全喪失，與蒜苗[16]中Cu2+、Ag+對CAT的強烈抑制作用相似，可能是因為金屬離子直接作用于酶的活性部位，減弱了酶的催化功能[24]，而在鴨肝[17]、貽貝[25]及火龍果[26]中Cu2+對酶有激活作用，可能是因為該金屬離子的加入促進反應時形成酶蛋白、金屬離子、底物三元配合物的穩定過渡態，從而降低反應的活化能，使酶促反應速度加快[29]。Pb2+對該酶活性有雙重作用，低濃度時對酶有激活作用高濃度時抑制酶活，可能是因為二價的 Pb2+的濃度會影響該酶本身的帶電情況，在低濃度時，可能對CAT的帶電量影響較弱，酶分子空間結構沒有發生明顯變化，并可以促進底物與酶活性中心相互結合，形成底物-酶-金屬離子復合物[23]，因而對酶有激活作用；但當Pb2+濃度增大時，大量Pb2+的聚集改變了酶蛋白本身的帶電情況，影響了酶分子的空間構型，從而逐漸抑制酶活性。Li+、Mn2+、Mg2+、K+、Ba2+、Ca2+對該酶都有一定的抑制作用，而在鴨肝[17]和貽貝[25]中Mg2+對酶有激活作用，在蒜苗[16]中Li+對酶有激活作用，K+對酶有雙重作用，在嗜熱鏈霉菌[27]中Ca2+對酶有激活作用，在蘆薈[13]中K+、Ba2+對酶有激活作用，以上對比結果說明了同種金屬離子對不同來源的CAT有不同的作用，可能是因為不同物種對環境的適應能力有差異和在進化過程中基因選擇性表達的結果[25]。

參考文獻：

[1] MCCLUNG C R. Regulation of catalases in Arabidopsis[J]. Free Radical Biology & Medicine, 1977, 23(3): 489-496.

[2] 張坤生, 田薈琳. 過氧化氫酶的功能及研究[J]. 食品科技, 2007, 32(1): 8-10.

[3] ALPTEKIN O, TUKEL S S, YILDIRIM D, et al. Characterization and properties of catalase immobilized onto controlled poreglass and its application in batch and plug flow type reactors[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2009, 58(1): 124-131.

[4] 劉靈芝, 鐘廣蓉, 熊蓮, 等. 過氧化氫酶的研究與應用新進展[J]. 化學與生物工程, 2009, 26(3): 15-18.

[5] TARHAN L. Use of immobilized catalase to remove H2O2used in thesterilization of milk[J]. Progress Biochemistry, 1995, 30(7): 623-628.

[6] ALACAM A, TULUNOGLU O, OYGUR T, et al. Effects of topical catalase application on dental pulp tissue: a histo-pathological evalution[J]. Journal of Dentistry, 2000, 28(5): 333-339.

[7] 張瑞萍. 過氧化氫酶在棉織物漂染工藝中的應用研究[J]. 印染, 2000, 26(8): 12-14.

[8] CHU H D, LEEDER J G, GILBERT S G. Immobilized catalase reactor for use in peroxide sterilization of dairy products[J]. Journal of Food Science, 2006, 40(3): 641-643.

[9] 曹翔宇, 華兆哲, 燕國梁, 等. 過氧化氫酶發酵生產條件優化及在染整清潔生產中的應用研究[J]. 工業微生物, 2007, 36(4): 7-12.

[10] MAURIZIO P, MASSIMILIANO F, PAOLA P, et al. Effect of stirrer speed and buffering agents on the production of glucose oxidase and catalase by Penicillium variabile (P16) in benchtop bioreactor[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1995, 17(4): 336-339.

[11] 解義勇. 黃豆營養價值的新發現[J]. 中國保健營養, 2002(8): 33.

[12] 戈儒乾. 合理膳食話黃豆[J]. 心血管病防治知識, 2005(4): 11.

[13] 朱鴻, 李想韻, 鄧玉. 等. 蘆薈過氧化氫酶的分離純化和性質研究[J].食品科學, 2010, 31(5): 206-210.

[14] 李建武, 余瑞元. 生物化學實驗原理和方法[M]. 北京: 北京大學出版社, 1994.

[15] 王鏡巖, 朱圣庚, 徐長法. 生物化學[M]. 北京: 高等教育出版社, 2002: 378-380.

[16] 胡瑞斌, 孫芳, 任美鳳, 等. 蒜苗過氧化氫酶的分離純化及部分性質研究[J]. 食品科學, 2013, 34(9): 250-255.

[17] 邱慧, 郭小路, 易燚波, 等. 鴨肝過氧化氫酶的分離純化及部分性質研究[J]. 西南大學學報: 自然科學版, 2008, 30(4): 163-168.

[18] 鄧向軍, 余筱潔. 蘋果過氧化氫酶的純化及性質研究[J]. 食品科技, 2006, 31(11): 66-68.

[19] 王凡強, 王正祥, 邵蔚藍, 等. 重組大腸桿菌熱穩定性過氧化氫酶的純化及性質研究[J]. 微生物學報, 2002, 42(3): 348-353.

[20] KANDUKRI S S, NOOR A, RANJINI S S, et al. Purification and characterization of catalase from sprouted black gram (Vigna mungo) seeds[J]. Journal of Chromatography B, 2012, 889: 50-54.

[21] 鄧玉, 敬海明, 成麗麗, 等. 韭菜過氧化氫酶的分離純化及其部分酶學特性[J]. 食品科學, 2011, 32(9): 217-221.

[22] 周娜磊, 李玥, 高媛, 等. 大鼠肝臟過氧化氫酶的分離純化及性質[J].氨基酸和生物資源, 2009, 31(2): 56-58.

[23] YAMAGUCHI H, SUGIYAMA K, HOSOYA M, et al. Gene cloning and biochemical characterization of a catalase from gluconobacteroxydans[J]. Journal of Bioscience and Bioengineer, 2011, 111(5): 522-527.

[24] 孫芳, 胡瑞斌, 任美鳳, 等. 鴨心蘋果酸脫氫酶的分離純化及酶學性質研究[J]. 食品科學, 2013, 34(23): 239-244.

[25] 孫芳, 任美鳳, 胡瑞斌, 等. 韭菜酸性磷酸酶的分離純化和部分性質研究[J]. 食品科學, 2013, 34(17): 187-191.

[26] 林少琴, 蘭瑞芳, 余萍, 等. 貽貝過氧化氫酶的純化及部分性質[J].食品科學, 2000, 21(11): 22-24.

[27] 張福平, 劉燕菁. 火龍果過氧化氫酶活性的研究[J]. 食品工業科技, 2008, 29(11): 128-132.

[28] 周一, 嚴自正, 張樹政, 等. 嗜熱鏈霉菌過氧化氫酶的純化及性質研究[J]. 微生物學報, 1990, 30(5): 336-343.

[29] 王健. 金屬離子對酶功能所起的作用[J]. 宜賓師專學報, 1993(2): 65-77.

Isolation, Purifi cation and Partial Characterization of Catalase from Soybean (Glycine max)

FANG Ling, SUN Caiyun, TANG Yunming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweet Potato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Electrophoresis-purity catalase (CAT) was obtained from freshly sprouted soybean (Glycine max) by the sequential steps of homogenization, buffer solution extraction, ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sepharose ion exchange chromatography and Superdex-200 gel filtration chromatography. The purifi ed enzyme had a specifi c activity of 26 322.43 U/mg, with a 30.92% activity recovery and a 293.09-fold purifi cation. The molecular mass of the CAT enzyme comprising a 57.42 kD subunit was 234.9 kD. Its optimum pH and temperature were 7.2 and 30 ℃, respectively. This enzyme was stable at pH 4.0–10.6 and at 25–35 ℃. Its Kmtowards H2O2was 31.82 mmol/L. The enzyme activity was strongly inhibited by sodium dodecyl sulfate (SDS), oxalic, Ag+and Cu2+, but was activated by low concentration of Pb2+.

soybean; catalase; isolation and purification; characterization

Q946.5

A

1002-6630（2015）01-0140-06

10.7506/spkx1002-6630-201501027

2014-02-09

重慶市科委科技攻關重點項目（CSTC2011AB1027）

方玲（1988—），女，碩士研究生，主要從事蛋白質與酶工程研究。E-mail：xuemeifl @163.com

*通信作者：唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn