方格星蟲多糖的分離純化及單糖組成

董蘭芳，張 琴，許明珠

（廣西壯族自治區海洋研究所，廣西海洋生物技術重點實驗室，廣西 北海 536000）

方格星蟲多糖的分離純化及單糖組成

董蘭芳，張 琴*，許明珠

（廣西壯族自治區海洋研究所，廣西海洋生物技術重點實驗室，廣西 北海 536000）

方格星蟲多糖經堿法提取、三氯乙酸脫蛋白、DEAE-52纖維素柱層析、Sephadex G-100凝膠柱層析純化得到精制方格星蟲多糖（Sipunculus nudus polysaccharide，SNPS）。測定SNPS的理化性質和單糖組成，結果表明：SNPS為白色粉末狀單一組分；經理化性質測定和紫外光譜分析，表明SNPS的多糖質量分數為99.35%，糖醛酸質量分數為22.21%，不含蛋白質和核酸，不含硫酸根；氣相色譜分析結果表明方格星蟲多糖SNPS主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，其物質的量比為1.16∶9.54∶1。本研究表明SNPS是從方格星蟲中得到的均一組分純多糖。

方格星蟲；多糖；纖維素；凝膠；單糖

多糖廣泛地存在于動物細胞膜、植物和微生物細胞壁中，是構成生命的四大基本物質之一。海洋生物多糖因具有免疫調節、抗凝血、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗菌、抗輻射、抗氧化等多種活性[1-9]，在醫療保健、食品加工、美容化妝等方面具有良好的應用前景，近年來，海洋生物多糖的藥用潛力逐漸被發掘出來。

方格星蟲（Sipunculus nudus）亦稱光裸星蟲，俗稱“沙蟲”，是無節、蠕蟲狀的海產體腔動物，為暖水性世界廣布種，我國沿海從南到北均有分布，其中以廣西海區資源較為豐富。方格星蟲具有豐富的營養物質，是一種具有多種機體調節功能的藥食佳品[10-13]。多糖是方格星蟲主要營養成分之一，已有研究表明，方格星蟲多糖（Sipunculus nudus polysaccharide，SNPS）具有抗病毒、抗輻射、抗疲勞、提高記憶力等多種生物學功能[14-17]。目前，國內外研究方格星蟲多糖生物活性[14-17]和提取工藝[18-19]的報道較多，而方格星蟲多糖的分離純化方法鮮有報道。本研究對方格星蟲多糖進行分離純化，并對其單糖組成進行了分析，以期為方格星蟲多糖產品的利用和開發提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

方格星蟲鮮活品，購于廣西北海市南珠市場。

DEAE-52纖維素、Sephadex G-100凝膠 北京慧德易科技有限責任公司；標準單糖：D（+）-葡萄糖（glucose，Glu）、木糖（xylose，Xyl）、果糖（fructose，Fru）、D-甘露糖（mannose，Man）、D-半乳糖（galactose，Gal）、D-阿拉伯糖（arabinose，Arb）、L-鼠李糖（rhamnose，Rha）、L（－）-巖藻糖（fucose，Fuc）、肌醇（inositol）和標準糖醛酸：D-半乳糖醛酸，均購自上海金穂生物科技有限公司；三氟乙酸（trifl uoroacetic acid，TFA）、無水乙醇、三氯乙酸、氯化鈉、氫氧化鈉均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

GC-2010Plus氣相色譜儀 日本島津公司；EZ-2溶劑蒸發工作站 英國Genevac公司；Thermo KR25i高速冷凍離心機 美國Jouan公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋江蘇常州賽普實驗儀器廠；BSZ-100自動部分收集器上海青浦滬西儀器廠；Milli-Q Biocel超純水機 美國Millipore公司；UV6300紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 方格星蟲多糖的提取

用剪 刀將鮮活的方格星蟲剖開，去除體腔液和內臟，體壁用蒸餾水洗凈，經高速組織勻漿機勻漿打碎成糊狀。體壁肉醬加入6 倍體積6% NaOH，50 ℃提取4 h，調pH值至7.0，9 000 r/min離心30 min，棄去沉淀，得上清液，用三氯乙酸法[20]去蛋白2～3 次，于工作站濃縮至終體積為原來的1/4左右，加乙醇至終體積分數為75%，4 ℃沉淀過夜。4 ℃、9 000 r/min離心10 min，沉淀以無水乙醇、丙酮洗滌多次，置于通風處晾干后用超純水溶解，用截留相對分子質量為10 000以上的玻璃紙流水透析48 h，乙醇再沉淀，離心，冷凍干燥得到方格星蟲粗多糖。

1.3.2 DEAE-52 纖維素柱層析

DEAE-52纖維素層析柱先用超純水平衡，方格星蟲粗多糖0.5 g用少量超純水溶解，9 000 r/min離心，取上清液上柱，0.5 mol/L NaCl洗脫，用恒流泵控制流速為1 mL/min，自動收集器收集，每管5 mL，以苯酚-硫酸法跟蹤檢測，以管號為橫坐標，吸光度A490nm為縱坐標繪制洗脫曲線。根據測定結果合并吸收峰的洗脫液，濃縮后用超純水透析至無Cl－，乙醇沉淀，離心，凍干。

1.3.3 Sephadex G-100凝膠柱層析

Sephadex G-100凝膠柱（2.6 cm×45 cm，40～120 μm）層析用超純水平衡過夜。經DEAE-52纖維素柱分離的方格星蟲多糖凍干品0.05 g用超純水溶解，0.45 μm濾膜過濾后上柱，用超純水以流速 0.2 mL/min洗脫，自動收集器收集，每管5 mL，以苯酚-硫酸法跟蹤檢測，以管號為橫坐標，吸光度A490nm為縱坐標繪制洗脫曲線。合并吸收峰洗脫液，于工作站減壓濃縮，冷凍干燥，得方格星蟲精制多糖。

1.3.4 多糖質量分數測定

將方格星蟲多糖配成1 mg/mL水溶液，以葡萄糖為標準品，按苯酚-硫酸法測定總糖質量分數。

1.3.5 糖醛酸質量分數測定

將方格星蟲精制多糖配制成5 mg/mL水溶液，取適量，以葡萄糖醛酸為標準品，按硫酸-咔唑法[21]測定糖醛酸質量分數。

1.3.6 硫酸根質量分數測定

取方格星蟲精制多糖5 mg，用1 mol/mL鹽酸完全水解后，以無水硫酸鉀為標準品，采用明膠-比濁法[22]測定硫酸根的質量分數。

1.3.7 蛋白質量分數測定

方格星蟲精制多糖以超純水配成1 mg/mL溶液，取適量，以牛血清白蛋白為標準品，采用Folin-酚法[23]測定蛋白質量分數。

1.3.8 紫外光譜分析

將純化后的方格星蟲多糖用超純水配成1 mg/mL溶液，以蒸餾水為空白對照，紫外分光光度計在190～400 nm波長范圍掃描檢測，看是否有無特征吸收。

1.3.9 單糖組成分析

多糖的水解：精密稱取5.0 mg方格星蟲精制多糖于厭氧水解管中，加入1.0 mL 2 mol/mL的TFA，充氮氣后蓋好軟塞，旋緊密封蓋，105 ℃水解6 h，水解液旋轉蒸發至干，加甲醇繼續旋蒸至干，重復3 次，以除去TFA。

單糖衍生物的制備：采用糖腈乙酸酯衍生法對單糖標準品和多糖水解得到的單糖樣品衍生后進行氣相色譜分析。單糖標準品和多糖水解樣品各5.0 mg，分別加入10.0 mg鹽酸羥胺，再加入0.5 mL吡啶，90 ℃水浴中加熱反應30 min，間歇振蕩。取出反應液冷卻至室溫，加入0.5 mL乙酸酐，90 ℃水浴中繼續反應30 min進行乙?；锰请嬉宜狨パ苌铩ｋx心，上清液直接作氣相色譜分析。

色譜條件：色譜柱為RTx-1石英毛細柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；氫火焰離子化檢測器（hydrogen flame ionization detector，FID）；升溫程序：初始溫度140 ℃，以6 ℃/min 升溫至240 ℃，保持5 min；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度250 ℃；載氣N2；進樣量1 μL。

2 結果與分析

2.1 方格星蟲多糖的分離純化

2.1.1 DEAE-52 纖維素柱層析

方格星蟲體壁經堿液提取、三氯乙酸脫蛋白、透析、醇沉、凍干處理后得黃褐色多糖粉末，易溶于水不溶于乙醇，得率為1.47%，多糖質量分數64.15%。由圖1可知，經過DEAE-52 纖維素陰離子交換層析，0.5 mol/L NaCl洗脫后只有一個洗脫峰，說明方格星蟲多糖為酸性多糖[24]，收集洗脫峰各管，透析脫鹽，濃縮后冷凍干燥得到一種DEAE-52纖維素純化乳白色粉末狀多糖級分SNPS’，經測定SNPS’多糖質量分數為88.37%。

圖1 DEAE-52纖維素柱純化方格星蟲多糖的洗脫曲線Fig.1 Elution curve of Sipunculus nudus polysaccharide on DEAE-52 celluose column

2.1.2 Sephadex G-100凝膠柱層析

圖2 Sephadex G-100 凝膠柱純化方格星蟲多糖的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of Sipunculus nudus polysaccharide on Sephadex G-100 column

由圖2可知，SNPS’過Sephadex G-100凝膠柱后，在19～25 管即洗脫體積為95～125 mL得到一個單一對稱性很好的洗脫峰，說明該組分為單一的多糖組分，透析、濃縮后凍干后，得到方格星蟲白色粉末狀精制多糖SNPS。

2.2 SNPS基本理化性質

結果表明，SNPS不含蛋白質，多糖質量分數為99.35%，純度較高，不含硫酸根，糖醛酸質量分數為22.21%。

圖3 方格星蟲多糖紫外光譜Fig.3 UV absorption spectrum of SNPS

2.3 SNPS紫外光譜分析由圖3可知，在195 nm波長處出現糖的較強吸收峰，在260 nm和280 nm波長處無明顯的蛋白、核酸吸收峰，這與蛋白質量分數測定結果相符，表明被測物為多糖，且不含核酸及蛋白質。因此，分離純化得到的SNPS為純多糖。

2.4 方格星蟲多糖SNPS單糖組成

圖4 混合標準單糖氣相色譜圖Fig.4 GC chromatogram of monosaccharide standards

圖5 SNPS氣相色譜圖Fig.5 GC chromatogram of SNPS

實驗以Glu、Xyl、Fru、Man、Gal、Arb、Rha和Fuc為標準單糖樣品，混合標準單糖衍生物的保留時間與每個標準單糖衍生物的保留時間進行對照比較，確定各單糖衍生物的出峰時間。由圖4各單糖衍生物的保留時間依次為Rha 7.934 min，Arb 8.127 min，Xyl 8.303 min，Fuc 11.724 min，Glu 11.845 min，Man 11.978 min，Gal 12.287 min，Inositol 14.083 min，Fru 16.355 min。對方格星蟲多糖單糖組成氣相色譜圖（圖5）分析可知，SNPS中1～3 號峰的保留時間與標準單糖氣相色譜圖中峰2、5、7保留時間基本一致，表明峰1為阿拉伯糖，峰2為葡萄糖，峰3為半乳糖，從而證明SNPS由葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖3 種單糖組成，物質的量比為1.16∶9.54∶1。另外，多糖氣相譜圖中存在不少雜峰，這是由于多糖水解衍生過程復雜，使用試劑較多，試劑可能有殘留或試劑不純。劉玉明等[25]測定了方格星蟲的單糖組成為阿拉伯糖和葡萄糖，質量分數分別為7.91%和79.32%；張桂和等[26]通過紅外光譜分析確定方格星蟲體壁多糖中存在木糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。這與本實驗測定結果有一些差異，這可能是提取純化處理方法、單糖測定方法、材料來源等的不同造成的。

3 結 論

方格星蟲粗多糖經DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-100凝膠柱純化后得到白色粉末狀單一組分SNPS。理化性質測定及紫外光譜分析結果：SNPS多糖質量分數為99.35%，不含蛋白質和核酸，不含硫酸根，糖醛酸質量分數為22.21%。上述結果表明采用DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-100凝膠柱層析的常規方法對于純化方格星蟲多糖具有良好的效果。氣相色譜分析結果表明SNPS由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖3 種單糖組成，物質的量比為1.16∶9.54∶1。

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Isolation, Purifi cation and Monosaccharide Analysis of Polysaccharide from Sipunculus nudus

DONG Lanfang, ZHANG Qin*, XU Mingzhu
(Key Laboratory of Marine Biotechnology of Guangxi, Guangxi Institute of Oceanology, Beihai 536000, China)

Crude polysaccharide was obtained from Sipunculus nudus by alkali extraction and deproteinized by Sevag method. The polysaccharide was sequentially purified by ion exchange chromatography on DEAE-52 cellulose column and Sephadex G-100 Gel column. Then, the purified polysaccharide from Sipunculus nudus (SNPS) was characterized for physicochemical properties and monosaccharide composition. The results showed that SNPS with a purity of 99.35% contained 22.21% alduronic acid without protein, nuclein or sulfate ions. Gas chromatography analysis showed that the monosaccharide compositions of SNPS were arabinose, glucose and galactose, with a molar ratio of 1.16:9.54:1. This study demonstrated that SNPS was a homogeneous component obtained from Sipunculus nudus.

Sipunculus nudus; polysaccharide; cellulose; gel; monosacharide

R284.2

A

1002-6630（2015）01-0109-04

10.7506/spkx1002-6630-201501021

2014-02-25

廣西科學研究與技術開發計劃項目（桂科攻11107011-6）；廣西科學院基本科研業務費資助項目（12YJ25HYS20）

董蘭芳（1987—），女，助理研究員，本科，主要從事水產動物天然產物開發的研究。E-mail：0xiao0dong0@163.com

*通信作者：張琴（1982—），女，副研究員，博士，主要從事水產動物天然產物開發研究。E-mail：celery996@yahoo.com.cn