高壓腌制對雞胸肉微觀結構的影響

冷雪嬌，鄧紹林，章 林，黃 明,*，周光宏

（1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210046；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

高壓腌制對雞胸肉微觀結構的影響

冷雪嬌1,2，鄧紹林2，章 林2，黃 明2,*，周光宏2

（1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210046；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

采用食鹽質量濃度為40 g/L的腌制液，在不同壓力條件下（0.1、50、100、150、200、300 MPa，保壓時間20 min）腌制雞胸肉，應用低場核磁共振、明場相差顯微鏡和透射電鏡研究雞胸肉在不同壓力條件下微觀結構的變化。結果表明：高壓腌制處理對雞胸肉的水分存在狀態具有顯著的影響（P＜0.05），300 MPa時的T22向慢弛豫方向移動，150 MPa時的不易流動水占總水分的百分含量最高。150 MPa以下處理組的肌肉組織結構無顯著差異，肌細胞形狀規則，排列有序；200 MPa處理下雞胸肉的肌纖維排列疏松，肌纖維之間肌束膜開始破裂；300 MPa處理下雞胸肉的肌束膜發生大量斷裂和崩解，雞胸肉的肌原纖維結構也發生明顯變化，Z線和I帶被徹底破壞，在Z線和M線附近形成了重聚體，肌纖維絲發生消融。150 MPa處理組的雞胸肉肌肉結構保持良好。

高壓；腌制；雞胸肉；微觀結構

腌制是指用食鹽或以食鹽為主，并添加硝酸鈉（或鉀）、亞硝酸鈉、蔗糖和香辛料等腌制輔料處理肉類的過程，是肉制品加工過程中一個重要的環節[1]。常用的腌制方法基本可分為干腌、濕腌、鹽水注射及混合腌制法四種，但基本都存在腌制周期較長，腌制效率低等問題。超高壓作為近年來新興的一門技術能夠有效縮短肉制品的腌制周期，提高腌制效率[2-4]，并且還能夠抑制微生物生長[5]、保持肉品原有的天然色、香、味和營養成分[6-10]，從而使得高壓處理的腌制技術成為新的研究熱點。

目前關于高壓的研究大多集中在采用相對較高的壓力，比如400、600 MPa的高壓進行殺菌和嫩化，然而過高的壓力會導致肉的顏色發白，脂肪發生氧化[11]等問題，從而使得肉品品質下降。但是，在較低壓力下進行腌制對雞胸肉的食用品質影響較小，并且，有研究表明高壓能有效提高雞胸肉的腌制速率，150 MPa腌制處理時食鹽的擴散速率最大，另外，高壓腌制還能改善雞胸肉的嫩度，增強保水性[3,12]。

此外，高壓處理可能會對肌肉的微觀結構產生一定的影響。肌肉的微觀結構能夠反映出肌肉的品質，例如肌纖維直徑的變化能反映肌纖維特性的變化情況、肌纖維的組織學特性與肌肉品質特性，特別是和食用品質密切相關。肌纖維越細，肌纖維密度越大，保水性越大，肉質越細嫩；肌纖維直徑越大，肌纖維密度越小，保水性越小，肉質越老[13]。本實驗從微觀角度出發，用低場核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）、明場相差顯微鏡和透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）等技術，研究雞胸肉在不同壓力條件下微觀結構的變化，以期為高壓條件下腌制雞胸肉食用品質的變化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

24 只三黃雞購于南京市童衛路農貿市場，每只質量約1.5 kg，宰殺取其胸肉，置于4 ℃冷庫成熟24 h后使用。

1.2 儀器與設備

UHPF/2L/800MPa型食品高壓設備 包頭科發高新技術食品機械有限公司；H-600型透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司；SX-40型光學顯微鏡 日本Akashi公司；1850型冷凍切片機 德國Leica公司；PQ001臺式NMR分析儀 上海紐邁電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高壓處理方法

將成熟24 h后的雞胸肉置于真空包裝袋中，以料液比（m/V）為1∶3加添食鹽質量濃度為40 g/L的腌制液，排除氣泡后用封口機封口，最后置于高壓設備中進行處理。在壓力分別為50、100、150、200、250、300 MPa條件下腌制20 min，以常壓（0.1 MPa）腌制20 min作為對照。研究表明常溫條件下壓力每升高100 MPa溫度升高3 ℃[14]，為控制高壓腌制時溫度保持在（25±1）℃，在高壓處理前將傳壓介質（蒸餾水）初始溫度降至16～24 ℃，如表1所示[3]。腌制結束時取出雞胸肉，用吸水紙擦干肉表面水分，用核磁共振、明場相差顯微鏡和透射電鏡研究雞胸肉在不同壓力處理條件下微觀結構的變化。

表1 高壓腌制時溫度的控制描述[3]Table 1 Description of temperature control during high pressure brining[3]

1.3.2 不同壓力腌制雞胸肉的NMR水分存在狀態測定

取2 g體積約為1 cm×1 cm×2 cm的雞胸肉（來自4 只不同的雞）4 份，分別放入檢測管中進行低場核磁共振檢測，最后取4 次檢測結果的平均值作為鮮雞胸肉的每個時間點的弛豫特征值。

將樣品管放入樣品池中，打開核磁共振分析軟件進入硬脈沖序列。利用CPMG脈沖序列測量樣品的自旋-自旋弛豫時間（T2）。將樣品分別置于磁場中心位置的射頻線圈的中心，利用FID信號調節共振中心頻率，然后進行CPMG脈沖序列掃描實驗。參數設置為：PulSeqType=2，SF1=22 MHz， O1=482.173 096 kHz，SW=100 kHz，Ds=120，RG1=30，RG2=3，TR=4 000 ms，I=150，EchoCount=500，NS=2。采樣結束后進行T2擬合保存實驗結果，然后進入T2反演軟件反演出實驗結果。

1.3.3 光學顯微鏡觀察不同壓力腌制的雞胸肉

從每個肉樣上順肌纖維方向取0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm肉樣，樣品放入液氮中凍結12 h，沿肌纖維垂直方向冰凍切片，切片厚度為10 μm。固定于經過APES包被的載玻片上，晾片5 min。切片染色步驟：蘇木素染液浸染3 min，70%和80%乙醇梯度脫水，然后用85%乙醇配制的酸化的伊紅溶液染色30 s，80%、90%和100%梯度乙醇脫水，二甲苯通透，中性樹膠封片。制備好的玻片在顯微鏡下進行觀察。

用Image-pro plus 軟件（5.1 MEDIA Cybernetics inc. USA）測量肌纖維直徑。測量時，每張照片隨機選擇10個測量點取平均值。

1.3.4 透射電鏡觀察不同壓力腌制的雞胸肉[15]

將0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的樣品于2.5%戊二醛（25%戊二醛溶液與0.1 mol/L、pH 7.4 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）按1∶9體積比混合即可）中4 ℃固定3 d，然后經PBS（pH 7.4）清洗3 次，再于1%餓酸中固定1.5 h，然后再經PBS清洗3 次，30 min/次；之后，乙醇逐級（30%、50%、70%、90%、100%、100%）脫水，每級20 min；最后用環氧丙烷置換。脫水后的樣品于Epon-812樹脂和丙酮等體積混合液中滲透4 h，再在純Epon-812樹脂中過夜滲透；然后將樣品包埋，放入聚合器中聚合（35 ℃，24 h；45 ℃，24 h；60 ℃，48 h）聚合后的樣品在實體顯微鏡下修塊，半薄切片定位，LKB-V超薄切片機切片；超薄切片用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，自然干燥后在透射電子顯微鏡下拍照，用游標卡尺測量肌原纖維直徑，肌節長度（兩條Z線之間的距離），每張照片隨機選擇20 個測量點測量肌節長度，觀察肌纖維的微觀結構基本特性。

1.4 數據分析方法

所有數據均為4次重復的平均值，數據統計采用SAS 8.0軟件進行單因素方差分析（one way ANOVA），差異的顯著性采用Duncan’s多重檢驗（P＜0.05，差異顯著） 。

2 結果與分析

2.1 不同壓力對腌制雞胸肉中水分存在狀態的影響

圖1 高壓腌制雞胸肉的NMR的反演圖（n=4）Fig.1 Inversion map of NMR of chicken breast brined by high pressure (n = 4)

圖2 高壓腌制雞胸肉NMR水分分布圖（n=4）Fig.2 Water distribution of NMR in chicken breast brined by high pressure（n=4）

由圖1可知，肉中的水分基本呈現出3 個波峰，第一個波峰在1～10 ms之間，第二個波峰在30～130 ms之間，第三個波峰則在150～305 ms之間。核磁共振能夠表征氫核在磁場中的弛豫特性，進而根據弛豫特征將水區分為若干狀態，以結合程度來分，肉品中水分可分為結合水、不易流動水和自由水，根據核磁弛豫時間可將T2分為T21、T22、T23，分別對應圖1中1～10 ms、30～130 ms和150～305 ms之間的3 個波峰。

高壓作用下雞胸肉的微觀結構變化可能導致內部毛細管分布改變，水的保持和體系毛細管作用相關。由圖1可知，50 MPa和100 MPa腌制雞胸肉時會縮短雞胸肉的T2弛豫時間，與前人的研究結果相似：Bertram等[16]的研究表明高壓處理會縮小牛肉的T2時間，這說明高壓處理會使肌肉中的水分更加緊密地保留在網狀蛋白中間，從而使肌肉的保水性增加。由圖2可知，經過腌制后雞胸肉的T21所占雞胸肉總水分的百分含量幾乎不變，這是因為這些水分都是結合水，與蛋白質分子表面緊密結合在一起。T22和T23的值和百分含量則不斷變化，結合常壓腌制發現，T22對應的不易流動水的百分含量隨著壓力的升高先增大后減小，150 MPa的不易流動水所占總水分的比例最大。T23對應的是自由水的百分含量則先減小后增大，150 MPa的自由水含量最低，300 MPa的自由水含量最高。

2.2 光學顯微鏡觀察不同壓力腌制雞胸肉的結果

圖3 高壓腌制雞胸肉肌纖維的變化（×400）Fig.3 Changes of muscle fi bers in chicken breast brined by high pressure (×400)

圖3 是雞胸肉在不同壓力腌制條件下放大400 倍后微觀結構變化的光學顯微鏡圖，雞胸肉經過高壓腌制后，微觀結構發生了很大的變化。50～150 MPa處理后，在光學顯微鏡下，各個肌肉組織結構有差異但不顯著，雞胸肉的肌細胞形狀規則，排列有序；200 MPa雞胸肉的肌纖維排列疏松，肌纖維之間肌束膜開始破裂，300 MPa時雞胸肉的肌束膜也發生大量斷裂和崩解，幾乎消失。

圖4 高壓腌制雞胸肉肌纖維直徑的變化（n=4）=4Fig.4 Changes in diameters of muscle fi bers in chicken breast brined by high pressure (n = 4)

由圖4可知，壓力對腌制雞胸肉的肌纖維直徑影響顯著（P＜0.05），隨著腌制壓力的升高雞胸肉的肌纖維直徑先增加后減小。100 MPa之前肌纖維直徑隨著壓力的升高而增高，這從微觀層面上解釋了本課題組前期研究發現雞胸肉肉質隨著壓力的升高而變老這一現象[12]。200 MPa以后肌纖維直徑隨著壓力的增高而降低，但本課題組前期研究發現200 MPa以后雞胸肉并沒有變嫩[12]，這是因為200 MPa以后肌束膜發生破裂，導致肌纖維束松散，肌纖維直徑并沒有真正的變小。

2.3 透射電鏡觀察不同壓力腌制雞胸肉的結果

圖5 高壓腌制雞胸肉肌纖維的縱切面變化Fig.5 Changes in longitudinal section of muscle fi bers in chicken breast brined by high pressure

不同壓力條件下腌制雞胸肉的微觀結構如圖5所示，0.1、50 MPa條件下腌制的雞胸肉有清晰可見的M線、Z線，這些線附近的H帶、I帶，以及I帶之間的A帶。兩條Z線之間的部分叫做肌節，很多個肌節單元組成了肌原纖維。100、150 MPa壓力處理后雞胸肉的H帶已經開始模糊，但肌節仍然清晰可見。200 MPa時H帶已經徹底消失，I帶也在減小。300 MPa條件下腌制的雞胸肉肌原纖維結構產生顯著的變化，Z線和I帶被徹底破壞，在Z線和M線附近形成了重聚體，肌纖維絲也發生了消融。

高壓處理后肌肉微觀結構的變化會因壓力水平和肉類品種的不同而不同。Iwasaki等[17]用免疫電子顯微鏡觀察高壓處理后的雞肉，證實用大于200 MPa的壓力保壓10 min可以破壞雞肉肌原纖維的Z線。而對于豬肉，當壓力升至400 MPa和500 MPa時才觀察到A帶斷裂[18]。Villacís等[2]則用透射電鏡觀察到高壓腌制火雞胸肉時，150 MPa時肌原纖維發生溶脹，M線消失，Z線斷裂，A帶和I帶縮短，肌節長度短于對照組，這是由高壓的壓縮作用引起的，Z線的破裂是因為與Z線相連的肌原纖維細絲的基本構成部分F-actin發生變性；300 MPa時肌原纖維發生巨大的變化，Z線和I帶被徹底破壞，在Z線和M線附近形成一個非常密集的再凝集物質，從而使肉品的保水性下降。對于魚肉來說，小于150 MPa的壓力就可以導致Z線破壞和A帶斷裂，這可能是由于不同肉類肌原纖維蛋白結構不同所致，而150 MPa處理后，肌肉的肌節收縮，肌原纖維變粗，Z線、M線和H區消失，粗絲和細絲零亂交錯，A帶和I帶斷裂，經450 MPa處理后，肌原纖維的肌節己被徹底破壞，難以辨認A帶和I帶，肌原纖維間隙消失，蛋白質膠凝化現象嚴重[19]。因此，對于不同品種的肉，不同的壓力強度和處理時間，會對肉的品質產生不同的影響。

圖6 高壓腌制雞胸肉肌節長度的變化（n=4）Fig.6 Changes in sarcomere length of chicken breast brined by high pressure (n = 4)

肌纖維是禽肉的基本構造單位，其直徑的變化反映了肌纖維特性的變化情況。許多研究表明，肌纖維的組織學特性與肌肉品質特性特別是食用品質性狀密切相關[13]，嫩度決定于肌纖維和肉中的結締組織，其中肌纖維的作用更大一些。一般認為，肌纖維絲越細，密度越大，系水力越強，肉質越細嫩。肌節長度也對嫩度具有很大程度的決定作用，肌節長度越長，肌肉越細嫩[20]。由圖6可知，不同壓力下雞胸肉肌節長度具有顯著的變化（P＜0.05），與常壓腌制相比，50、100 MPa的肌節長度稍長，而150 MPa之后肌節長度則慢慢降低，這與150 MPa之后剪切力值的上升[6]有很大關系。

3 結 論

高壓處理對腌制雞胸肉的水分存在狀態具有顯著的影響（P＜0.05），150 MPa處理腌制雞胸肉的不易流動水占總水分的百分含量最高，自由水占總水分的百分比最低。壓力小于150 MPa的處理組在光學顯微鏡下各個肌肉組織結構沒有顯著差異且雞胸肉的肌細胞形狀規則，排列有序，100、150 MPa的H帶已經開始模糊，但肌節仍然清晰可見，200 MPa時H帶已經徹底消失，I帶也在減小，300 MPa時肌原纖維結構產生顯著的變化，Z線和I帶被徹底破壞，在Z線和M線附近形成了重聚體，肌纖維絲也發生了消融，因此150 MPa處理組的雞胸肉肌肉結構保持較好。

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Effect of High Pressure Brining on Microstructure of Chicken Breast

LENG Xuejiao1,2, DENG Shaolin2, ZHANG Lin2, HUANG Ming2,*, ZHOU Guanghong2
(1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The objective of this study was to investigate the effect of high pressure brining on microstructure of chicken breast. Chicken breast was brined under different pressure levels (0.1, 50, 100, 150, 200 or 300 MPa for 20 min) in 40 g/L salt solution. Nuclear magnetic resonance (NMR), optical microscope and transmission electron microscopy (TEM) were used to characterize the microstructure of chicken breast. The results showed that high pressure brining had signifi cant effects on the state of water in chicken breast (P < 0.05). At 300 MPa, T22was shifted towards to slow relaxation direction, and more immobile water than free water at 150 MPa was observed. At a pressure less than 150 MPa, some differences but not obvious in the muscle cell shape were observed. Chicken breast muscle fi ber arranged loosely at 200 MPa, and muscle fi ber perimysium began to burst at 200 MPa. When brining at 300 MPa, the perimysium of chicken breast muscle become disintegrated. Chicken myofi brillar structure brined at 300 MPa had a signifi cant change; Z line and I band were completely destroyed, thus forming a reunion body near them, and the ablation of fi bers was also observed. Therefore, 150 MPa could provide better maintenance of muscle fi ber structure.

high pressure; brining; chicken breast; microstructure

TS251.1

A

1002-6630（2015）01-0099-05

10.7506/spkx1002-6630-201501019

2014-03-06

江蘇省自然科學基金項目（BK2009314）；南京中醫藥大學校青年自然科學基金項目（13XZR29）

冷雪嬌（1988—），女，助理實驗師，碩士，研究方向為食品安全與工藝。E-mail：leng.xuejiao2008@163.com

*通信作者：黃明（1970—），男，教授，博士，研究方向為肉類質量與安全控制。E-mail：mhuang@njau.edu.cn