雷帕霉素聯合順鉑對卵巢癌SKOV-3細胞株三磷酸腺苷含量以及新生血管生成的影響

鄧中華

（江西省吉安市中心人民醫院藥劑科，江西 吉安 343000）

·論著·

雷帕霉素聯合順鉑對卵巢癌SKOV-3細胞株三磷酸腺苷含量以及新生血管生成的影響

鄧中華

（江西省吉安市中心人民醫院藥劑科，江西 吉安 343000）

目的研究雷帕霉素聯合順鉑對卵巢癌SKOV-3細胞株三磷酸腺苷（ATP）以及新生血管生成的影響。方法培養卵巢癌SKOV-3細胞株，分為空白對照組（不含胎牛血清和藥物的培養基處理）、順鉑組（10μmol/L順鉑處理）、雷帕霉素組（40 nmol/L雷帕霉素處理）、聯合用藥組（10μmol/L順鉑+40 nmol/L雷帕霉素處理），檢測細胞活力、ATP生成量以及上清液中血管內皮生長因子（VEGF）含量。結果順鉑組、雷帕霉素組和聯合用藥組的MTT值、ATP含量以及VEGF含量均低于空白對照組，且聯合用藥組的MTT值、ATP含量以及VEGF含量低于順鉑組和雷帕霉素組。結論雷帕霉素和順鉑能夠抑制卵巢癌SKOV-3細胞株ATP以及新生血管的生成，且兩種藥物聯合應用時具有協同作用。

卵巢癌；雷帕霉素；順鉑；三磷酸腺苷；血管內皮生長因子

卵巢癌是一類對化療較為敏感的惡性腫瘤，臨床上多采用以順鉑為基礎的化療方案來進行治療。但是，仍有部分患者會在化療后出現耐藥或復發，這也是造成治療失敗以及預后不良的主要原因。mTOR是一類在細胞增殖、細胞周期、細胞遷移等過程中發揮重要調控的分子，雷帕霉素是mTOR特異性的抑制劑，對惡性腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的生物學行為具有抑制作用，而這一惡性生物學行為又依賴于三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）所提供的能量以及新生血管形成所提供的氧氣和能量物質。本研究從ATP及新生血管生成的角度分析了雷帕霉素聯合順鉑對卵巢癌SKOV-3細胞株ATP以及新生血管生成的影響。

1 材料與方法

1.1材料

卵巢癌SKOV-3細胞株由中科院細胞庫提供；細胞培養用的DMEM/F12培養基及胎牛血清由Gbico公司提供，噻唑藍（MTT）檢測試劑由Promega公司提供，ATP檢測試劑由碧云天公司提供；酶聯免疫吸附試劑盒由上海邦奕公式提供，雷帕霉素及順鉑等藥物均由Cayman公司提供，常規耗材購買于Nest生物公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養方法凍存在液氮罐中的細胞取出后復蘇，在15 cm2的培養瓶中培養，待細胞處于對數生長期且鋪滿培養瓶底面70%～80%時進行傳代，分別接種于培養瓶和培養板中。培養瓶中的細胞用于繼續傳代，培養板中的細胞用于加藥處理。

1.2.2細胞處理方法當培養板中的細胞鋪滿50%～60%時，用不含胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的培養基處理細胞24 h，使其生長同步化，而后分別用不含FBS和藥物的培養基（空白對照組）、10μmol/L順鉑（順鉑組）、40 nmol/L雷帕霉素（雷帕霉素組）、10μmol/L順鉑+40 nmol/L雷帕霉素（聯合用藥組）處理。24 h后收集細胞上清液檢測血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF），收集細胞檢測MTT和ATP。

1.2.3MTT檢測采用promega公司的MTS試劑盒檢測MTT值，藥物處理24 h后直接在細胞培養孔中加入MTS檢測試劑200μl，在孵箱中孵育3～4 h，待檢測試劑變色后在酶標儀上讀取490 nm處的吸光值作為MTT值，以空白對照組的MTT值為100，計算順鉑組、雷帕霉素組、聯合用藥組的MTT相對值。

1.2.4ATP檢測采用碧云天公司的ATP檢測試劑盒（產品編號S0026）檢測細胞中ATP的含量，同時采用BCA法測定同一細胞孔中細胞內總蛋白含量，計算每毫克細胞總蛋白中ATP的含量，并以此來反應不同處理組間的ATP含量。

1.2.5VEGF檢測采用上海邦奕公式的酶聯免疫吸附試劑盒VEGFA（DRE11354）、VEGFB（DRE10433）、VEGFC（DRE10430）檢測細胞上清液中VEGF不同亞型的含量。

1.3統計學方法

本研究所有數據均采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（x±s），組間分析采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05判斷差異有統計學意義。

2 結果

2.1MTT檢測結果

順鉑組、雷帕霉素組、聯合用藥組的MTT值分別為（42.5±8.4）、（45.2±7.2）和（19.4±4.7），均低于空白對照組的（100±17.3），差異有統計學意義（P＜0.05），且聯合用藥組的MTT值低于順鉑組和雷帕霉素組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同處理組SKOV-3細胞株的MTT檢測結果

2.2ATP檢測結果

順鉑組、雷帕霉素組、聯合用藥組的ATP含量分別為（73.2±11.1）、（69.5±9.5）和（25.4±4.6）nmol/mg，均低于空白對照組的（167.3±23.2）nmol/mg，差異有統計學意義（P＜0.05），且聯合用藥組的ATP含量低于順鉑組和雷帕霉素組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3VEGF檢測結果

經方差分析，4組間VEGF的含量差異有統計學意義（P＜0.05），且順鉑組、雷帕霉素組和聯合用藥組的VEGFA、VEGFB及VEGFC含量低于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），聯合用藥組的VEGFA、VEGFB及VEGFC含量低于順鉑組和雷帕霉素組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見附表。

圖2 不同處理組SKOV-3細胞株的ATP含量

附表4 組細胞上清液中VEGF含量比較（ng/mg±s）

附表4 組細胞上清液中VEGF含量比較（ng/mg±s）

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05；2）聯合用藥組與順鉑組和雷帕霉素組比較，P＜0.05

組別VEGFAVEGFBVEGFC空白對照組76.8±9.5169.2±30.1200.4±33.7順鉑組34.5±6.41）103.7±18.51）94.2±11.41）雷帕霉素組聯合用藥組40.8±7.11）19.3±2.81）2）110.4±16.21）48.2±7.51）2）104.5±15.91）39.4±6.51）2）F值26.2419.4924.25 P值0.0010.0010.001

3 討論

卵巢癌是生殖系統高發的惡性腫瘤，臨床上多采用順鉑為基礎的化療方案來處理卵巢癌，盡管卵巢癌細胞對順鉑較為敏感，但耐藥和復發仍成為治療失敗的最重要原因[1]。因此，探尋不同作用靶點的藥物在卵巢癌的治療中具有現實的應用價值。mTOR由2549個氨基酸組成，屬于非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以整合能量代謝、氨基酸代謝、葡萄糖代謝以及生長因子所激發的各種信號通路，進而參與細胞增殖、細胞周期、細胞遷移等過程的調控，并且與cyclin D及c-myc等原癌基因的激活密切相關[3]。VAN DER BILT AR[4]的體外研究結果顯示，采用小RNA干擾的技術靶向抑制PI3K/AKT介導的mTOR信號通路不僅能夠顯著抑制細胞的增殖過程，還能發揮強烈的抗血管新生作用。

近年來，越來越多的研究認識到mTOR表達異常在惡性腫瘤發生過程中發揮了至關重要的作用，張斌等[5]的研究發現，卵巢上皮癌組織中磷酸化mTOR的陽性率高達53.9%，而在正常卵巢組織和良性卵巢上皮腫瘤組織中磷酸化mTOR均為陰性。HIRASAWA等[6]的體外實驗也發現，mTOR的過度激活會增強卵巢癌細胞株的惡性生物學行為，包括增殖、遷移以及侵襲。因此，抑制mTOR的激活也成為了治療卵巢癌最具前景的治療靶點。雷帕霉素的主要作用靶點是mTOR受體，屬于mTOR信號通路的拮抗劑[7]，能夠通過與FK506結合蛋白在空間上相互靠近并抑制下游蛋白S6K1、4E-BP1發生磷酸化，進而抑制下游相關基因mRNA轉錄、蛋白翻譯，并最終實現對細胞周期的負性調控[8]。

目前，國內外已有關于雷帕霉素處理卵巢癌細胞株的體外研究，國內段釗[9]通過體外培養卵巢癌SKOV-3細胞株發現，雷帕霉素聯合順鉑處理能夠顯著抑制細胞的增殖并影響細胞周期，使細胞停滯于G1期而不進入S期；國外SHEPPARD等[10]的研究也發現，雷帕霉素處理可以抑制SKOV-3細胞的遷移和侵襲過程。本研究通過MTT法檢測卵巢癌SKOV-3株也同樣發現，順鉑和雷帕霉素處理均能抑制細胞增殖，且兩種藥物聯合應用具有協同作用，順鉑聯合雷帕霉素處理組的MTT值顯著低于單藥處理組。這一結果反映出mTOR抑制劑雷帕霉素在抑制卵巢癌惡性生物學行為中的積極價值。

事實上，卵巢癌細胞無限增殖、遠處轉移的惡性生物學行為的完成主要依靠ATP所提供的能力以及新生血管所提供的氧氣和養分。惡性腫瘤細胞向周圍組織遷移和侵潤是一個主動的耗能過程，需要通過氧化磷酸化產生ATP提供能力，并在基質金屬蛋白酶、轉化生長因子等細胞因子的輔助下完成對細胞外基質的降解以及向周圍組織的移行。腫瘤組織中大量新生血管可以為氧化磷酸化提供充足的氧氣以及葡萄糖等物質，而在這一過程中，腫瘤瘤體分泌大量的細胞因子直接參與血管新生的過程，其中VEGF是目前為止已知作用最為明確的一類促血管新生細胞因子。通過檢測ATP和VEGF含量可知，順鉑和雷帕霉素處理均能抑制ATP和VEGF的產生，并且兩種藥物聯合應用具有協同作用，順鉑聯合雷帕霉素處理組的ATP和VEGF含量均低于單藥處理組。

綜上所述，雷帕霉素和順鉑能夠抑制卵巢癌SKOV-3細胞株ATP以及新生血管的生成，且兩種藥物聯合應用時具有協同作用。

[1]馬湘一,范良生,劉榮華,等.卵巢上皮性癌中mTOR信號通路蛋白的表達及其臨床意義[J].中國婦幼保健,2011,26(30):4755-4757.

[2]張晟,張霄蓓,張瑾,等.磷脂酰肌醇3-激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑在乳腺癌治療中的研究進展[J].中國全科醫生,2012, 15(8C):2749-2754.

[3]韓璐,翟晶.雷帕霉素對人宮頸癌Hela細胞增殖和HIF-1及VEGF表達的影響[J].腫瘤防治研究,2013,40(3):245-248.

[4]VAN DER BILT AR,TERWISSCHA VAN SCHELTINGA AG, TIMMER-BOSSCHA H,et al.Measurement of tumor VEGF-A levels with 89Zr-bevacizumab PET as an early biomarker for the antiangiogenic effect of everolimus treatment in an ovarian cancer xenograft model[J].Clin Cancer Res,2012,18(22):6306-6014

[5]張斌,侯志勇,韋勵,等.卵巢上皮癌組織中p-mTOR的表達及意義[J].中國婦幼保健,2012,27(5):737-740.

[6]HIRASAWA T,MIYAZAWA M,YASUDA M,et al.Alterations of hypoxia-induced factor signaling pathway due to mammalian target of rapamycin(mTOR)suppression in ovarian clear cell adenocarcinoma:in vivo and in vitro explorations for clinical trial [J].Int J Gynecol Cancer,2013,23(7):1210-1218.

[7]劉奕,楊鳴良,張揚,等.哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白及其底物在口腔鱗狀細胞癌中的表達[J].華西口腔醫學雜志,2004,22(4): 331-333.

[8]FENG X,LI L,JIANG H,et al.Dihydroartemisinin potentiates the anticancer effect of cisplatin via mTOR inhibition in cisplatin-resistant ovarian cancer cells:involvement of apoptosis and autophagy[J].BiochemBiophysResCommun,2014,444(3): 376-381.

[9]段釗,楊雪梅,邢蘭瑛,等.雷帕霉素聯合順鉑對卵巢癌SKOV-3細胞增殖的抑制作用[J].西安交通大學學報(醫學版),2010,31(4): 493-496.

[10]SHEPPARD KE,CULLINANE C,HANNAN KM,et al.Synergistic inhibition of ovarian cancer cell growth by combining selective PI3K/mTOR and RAS/ERK pathway inhibitors[J].Eur J Cancer,2013,49(18):3936-3944.

（王榮兵 編輯）

Effect of rapamycin combined with cisplatin on ATP production and angiogenesis in human ovarian cancer SKOV-3 cell line

Zhong-hua DENG
(Department of Pharmacy,the Central People's Hospital of Ji'an City,Ji'an, Jiangxi 343000,P.R.China)

【Objective】To study the effect of rapamycin combined with cisplatin on adenosine triphosphate(ATP) production and angiogenesis in human ovarian cancer SKOV-3 cell line.【Methods】Human ovarian cancer SKOV-3 cell line were cultured and divided into blank control group(treated with medium without FBS and drug),cisplatin group(treated with 10 μmol/L cisplatin),rapamycin group(treated with 40 nmol/L rapamycin),combination group (treated with 10 μmol/L cisplatin combined with 40 nmol/L rapamycin).Then cell viability,ATP production and vascular endothelial growth factor(VEGF)content in supernant were detected.【Results】MTT value,ATP content and VEGF content of cisplatin group,rapamycin group and combination group were lower than those of blank control group.MTT value,ATP content and VEGF content of combination group were lower than those of cisplatin group and rapamycin group.【Conclusion】Rapamycin and cisplatin can inhibite ATP production and angiogenesis in human ovarian cancer SKOV-3 cell line,and combined use of two drugs has a synergistic effect.

ovarian cancer;rapamycin;cisplatin;adenosine triphosphate;vascular endothelial growth factor

R737.31

A

1005-8982（2015）25-0034-04

2015-04-10