活性維生素D3對IgA腎病大鼠腎組織中Toll樣受體4表達的影響

王纓，汪國平，李弼民

（南昌大學第一附屬醫院腎內科，江西 南昌 330006）

·論著·

活性維生素D3對IgA腎病大鼠腎組織中Toll樣受體4表達的影響

王纓，汪國平，李弼民

（南昌大學第一附屬醫院腎內科，江西 南昌 330006）

目的探討活性維生素D3對IgA腎?。↖gAN）大鼠保護作用的可能機制。方法50只大鼠隨機分為3組，正常對照組（NC組）10只、對照模型組（MC組）20只、活性維生素D3治療組（干預組）20只。干預組給予活性維生素D3灌胃8周。灌胃第4和8周末檢測24 h尿蛋白定量、腎功能及血漿清蛋白，采用酶聯免疫吸附測定血漿白細胞介素-1（IL-1）蛋白表達，免疫組織化學法檢測腎組織Toll樣受體4（TLR4）蛋白的表達。結果①與MC組比較，干預組血肌酐和24 h尿蛋白均下降（均P＜0.05）；②與NC組比較，MC組TLR4蛋白表達增加（P＜0.05）；與MC組比較，干預組TLR4蛋白表達下降（P＜0.05）；③與NC組比較，MC組IL-1表達增加（P＜0.05）；與MC組比較，干預組IL-1表達下降（P＜0.05）。結論活性維生素D3可通過抑制IgAN大鼠的TLR4的表達及細胞因子IL-1的表達，對IgAN大鼠腎臟損傷有預防保護作用。

IgA腎病；活性維生素D3；Toll樣受體4；白細胞介素-1；大鼠

IgA腎?。╥mmunoglobulin A nephropathy，I-gAN）是目前最常見的原發性腎小球疾病之一，IgAN典型的臨床表現為黏膜感染，尤其是上呼吸道感染同時或之后短期內伴發肉眼血尿。因此，研究認為天然黏膜免疫異常在IgAN的發生中有一定的作用。天然免疫分子Toll樣受體（toll-like receptor，TLRs）在天然免疫和獲得性免疫中均起重要的作用。既往研究表明，TLR4通路與IgAN關系密切。近年活性維生素D3[1,25(OH)2D3]的腎臟保護作用受到關注，本研究探討活性維生素D3對IgAN大鼠腎臟TLR4的表達的影響。現報道如下：

1 材料與方法

1.1試劑與藥品

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、牛血清蛋白（bovine serum protein，BSA）、四氯化碳（CCL4）（均購自美國Sigma公司），Anti-TLR4 antibody一抗、二抗（美國anbo公司），活性維生素D3由為上海羅氏制藥有限公司提供。

1.2實驗動物與飼養條件

本實驗所采用的50只大鼠均為SPF級雄性SD大鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2011-0003。體重均在180～200 g，保證飼養環境的適宜，定時定量飲水、喂食，待大鼠適應環境7 d后開始構建大鼠IgAN模型。

1.3動物模型的構建及分組

50只SPF級別的SD雄性大鼠按隨機數字表法分為兩組，正常對照組10只、造模組40只。造模組大鼠用BSA按400 mg/kg隔日灌胃，至造模結束共9周；在第6及8周末通過尾靜脈注射脂多糖，每只每次0.05 mg；每周日通過皮下注射CCL4，每只每次蓖麻油0.5 ml+CCL4 0.1 ml，共9周[1]；正常對照組（NC組）在相同時間給予正常對照組等體積蒸餾水灌胃，同體積生理鹽水皮下注射及同等量的生理鹽水尾靜脈注射。實驗第9周造模完成。造模完成后將40只模型組大鼠隨機分為對照模型組（MC組）和干預組，每組各20只。MC組和干預組均繼續予以BSA隔日灌胃（劑量同前），干預組給予1,25(OH)2D3溶于0.05 ml花生油以0.03μg/（kg·d）每日灌胃[2]，期間每周稱量體重，根據體重的變化計算藥物用量并作出調整。NC組和MC組大鼠每日灌喂同等量花生油，共8周。

1.4標本采集

于成模后及用藥4和8周末對各組大鼠采用眶靜脈采血法收集血液2～3 ml，靜置2 h，3 000 r/min離心5 min，取血清，-80℃凍存待測；并于各實驗點前用代謝籠留取各組大鼠24 h尿待測。于成模后及用藥4和8周末每組大鼠各處死一半，留取其腎組織待測。

1.5觀察指標與檢測方法

1.5.1相關因子檢測于成模后及用藥4和8周，檢測血肌酐（serum creatinine，Scr）、血白蛋白，檢測24 h尿蛋白定量。

1.5.2組織病理學觀察檢查采用HE染色。免疫熒光檢查：對IgA的沉積情況進行觀察，并關注熒光的強度及面積，在腎小球系膜區顯示為綠色視為陽性。

1.5.3腎組織TLR4蛋白的表達取腎組織標本，采用免疫組織化學檢測，4μm厚石蠟切片，脫蠟后微波修復（檸檬酸緩沖液，pH 6.0），3%過氧化氫H2O2孵育10 min，3%BSA封閉15 min，滴加羊抗TLR4抗體（英國abcam公司，1∶800）后4℃過夜，次日滴加二抗（英國abcam公司），37℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗3次后，DAB顯色，蘇木素復染，透明，封片。以TLR4在腎小管上皮細胞、系膜細胞胞漿染成黃色或棕色為陽性。觀察細胞染色陽性的強度及范圍。以定量積分法對蛋白表達量進行評價，每張切片至少觀察10個高倍鏡視野。染色強度評分：淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分，染色陽性范圍比例評分：1%～25%1分、26%～50%2分、51%～75%3分、76%～100%4分。以染色強度評分與陽性范圍比例評分的乘積為TLR4陽性積分。

1.5.4IL-1蛋白表達取血清標本，采用酶聯免疫吸附測定（emzyme-linked immuno sorbentassay，ELISA）法檢測，將標準品、待測樣本各50μl（待測樣本10μl，再加樣本稀釋液40μl）加入到已包被的酶標板，37℃恒溫箱溫育30 min，洗滌除去未結合的成分，再加入酶標工作液50μl，37℃恒溫箱溫育30 min，洗滌除去未結合的成分，依次加入底物工作液50μl，每孔加終止液50μl混勻，450 nm波長下測定OD值。酶標儀的讀數為每孔樣品和標準品的OD值，且可測出具體濃度數值，根據標準品的濃度和所測OD值求得標準曲線，再根據所得樣品OD值和標準曲線公式算出實測樣品的濃度值。

1.6統計學方法

數據以均數±標準差（x±s）表示，應用SPSS 13.0統計學分析軟件，單因素方差分析比較多組間均值的差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1一般情況

MC組在造模第4周時死亡大鼠1只，造模第7周時死亡大鼠1只；干預組1,25(OH)2D3治療4周時死亡大鼠1只。

在整個實驗過程中，對照組大鼠精神、活動無明顯異常，造模組部分大鼠在造模第6和8周尾靜脈注射LPS后，出現食欲不振或精神萎靡等，但一般1周后可自行緩解。

2.2各組大鼠不同時間點Scr、血漿清蛋白和24 h尿蛋白比較

Scr、血漿清蛋白和24 h尿蛋白MC組各時間點與NC組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；干預組第4和8周與MC組同時間點相比差異有統計學意義（P＜0.05）；干預組第8周與第4周相比差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠生化結果的比較（±s）

表1 各組大鼠生化結果的比較（±s）

注：1）同一時間點，與NC比較，P＜0.05；2）同一時間點，與MC組相比，P＜0.05；3）同一時間點，與干預組4周比較，P＜0.05

8周例結果24 h尿蛋白（mg/24 h）對照組104.65±0.41104.66±0.9054.90±0.40模型組干預組組別0周例結果結果4周例18 20 14.33±0.731）14.38±0.961）18 19 16.87±0.861）13.0±0.891）2）9 9 17.22±0.451）10.1±0.801）2）3）Scr/（μmol/L）對照組模型組干預組10 18 20 36.04±4.26 51.10±5.041）50.33±4.251）10 18 19 36.53±3.51 62.97±6.851）48.53±4.261）2）5 9 9 35.27±4.21 70.09±4.861）40.74±3.841）2）3）血清蛋白/（g/L）對照組1033.27±2.231033.32±2.73534.01±2.54模型組干預組18 20 26.59±1.531）26.14±1.511）18 19 23.28±2.071）27.16±1.581）2）9 9 21.44±1.431）29.50±1.661）2）3）

2.3光鏡和熒光顯微鏡下各組大鼠腎臟病理組織學觀察

光鏡下NC組大鼠未見病理改變，MC組在腎小球內可見明顯的系膜細胞增多，系膜基質中到重度增生，毛細血管管腔狹窄，腎間質內可見明顯的炎性細胞浸潤，并可見腫脹變性的腎小管上皮細胞。見圖1。熒光下NC組未見IgA沉積，MC組可見團塊狀或顆粒狀綠色IgA熒光。見圖2。

圖1 NC組和MC組大鼠腎組織病理改變（光鏡×400）

圖2 NC組和MC組大鼠腎組織中IgA的沉積（免疫熒光×400）

2.4TLR4的免疫組織化學染色

TLR4蛋白表達MC組各時間點與NC組比較差異有統計學意義（P＜0.05），干預組各時間點與MC組相比差異有統計學意義（P＜0.05），干預組8周時TLR4的表達較4周時明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3和表2。

表2 各組大鼠TLR4蛋白定量的比較（分，x±s）

表3 各組大鼠不同時間點IL-1蛋白表達水平比較[ρ/（ng/L）±s]

表3 各組大鼠不同時間點IL-1蛋白表達水平比較[ρ/（ng/L）±s]

注：1）與NC組相比，P＜0.05；2）與MC組相比，P＜0.05；3）與干預組4周比較，P＜0.05

組別4周8周例定量積分例定量積分NC組105.68±2.1257.13±3.24 MC組1961.15±35.461）975.31±59.121）干預組1841.13±15.21920.43±8.932）3）

2.5IL-1蛋白表達

大鼠IgAN模型構建成功后，炎性因子IL-1表達上調，并隨著疾病進展表達進一步增加。MC組與NC組同時間點相比差異均具有統計學意義（P＜0.05）；干預組8周時IL-1表達較MC組同時間點有明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。干預組8周時IL-1的表達較4周時明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

圖3 3組大鼠腎組織中TLR4的表達（免疫組織化學×400）

3 討論

IgAN的典型臨床表現是上呼吸道感染的短期內出現肉眼血尿或鏡下血尿，可伴有不同程度的蛋白尿。研究報道，上呼吸道或扁桃體感染可增加IgAN患者的血尿和蛋白尿。扁桃體摘除可有效治療某些IgAN患者，說明天然黏膜免疫異?？赡軈⑴c了IgAN的發生發展過程。

TLR是一種模式識別受體，目前TLR家族有11個成員，可識別環境中的病原體，啟動天然免疫和適應性免疫應答產生不同的效應分子，抵抗病原體的入侵，作為TLR家族中及其重要的成員TLR4在天然免疫反應中有十分重要的作用，黏膜感染時LPS可激活TLR4，其主要信號轉導途徑之一是通過一個銜接蛋白（MyD88）與TLRs細胞內TIR區域結合，導致轉錄因子（如NF-κB）的激活，從而促使大量細胞活性因子（IL-1、IL-6和IL-8）、黏附分子和炎癥因子的合成及轉錄表達，最終影響免疫與炎癥反應[3-6]。TLRs家族中TLR4除了介導細菌內毒素所致的炎癥反應外，還可介導肺臟、肝臟及腎臟IRI等非感染性炎癥反應，通過抑制TLR4活性可以起到一定的臟器保護作用[7-9]。

越來越多的研究表明：TLR4信號通路與腎臟疾病密切相關，對腎毒性腎炎模型的研究發現，TLR4配體通過對外周淋巴細胞及腎固有細胞的調控作用，在腎小球腎炎的發展中起重要作用[10]。COPPO等[11]發現IgAN患者外周血單核細胞中TLR4表達增加，且與尿蛋白及疾病活動時期相關。QIN等[12]發現細菌LPS激活TLR4可以導致Cosmc的甲基化，從而降低IgA1的糖基化程度，提示在IgAN的發生發展中，TLR4也起到一個重要的作用。

研究表明TLR4可能通過多種機制激活多種配體參與IgAN患者腎組織損傷[13-14]。TLR4信號通路激活后可引起相關細胞因子表達上調，導致腎組織炎癥反應，損傷的腎組織又可暴露纖維蛋白原及黏連蛋白等TLR4內源性配體，誘導TLR4的表達，形成惡性循環[15]。本研究通過構建大鼠IgAN模型，檢測TLR4在腎組織中表達較正常對照組明顯增加，主要表達于腎小球系膜細胞及腎小管上皮細胞中，提示在IgAN的發病中，TLR4信號通路是一個重要途徑。在2型糖尿病患者中研究發現TLR4表達增加，且與內毒素HSP60及HMGB1呈正相關，TLR4信號導致細胞因子水平升高，這其中就包括了IL-1[16]。本研究也觀察到IgAN大鼠中IL-1和TLR4有較大關聯，隨著TLR4的表達增加上調了IL-1在體內的表達而引起炎癥反應。

活性維生素D3不僅是調節體內鈣磷代謝平衡的重要激素，活性維生素D3可通過通過阻斷腎素-血管緊張素系統、直接抑制炎癥因子分泌、調節免疫、減少細胞外基質沉積和保護足細胞等對腎臟起到保護作用[17-19]。LI[17]研究活性維生素D3也能抑制腎成纖維細胞的增殖和轉化，具有抗系膜細胞增殖的活性，減輕腎間質纖維化，對腎臟起保護作用，延長患者生存率。BAEKE等[20]研究發現，活性維生素D3能夠抑制單核細胞的TLR4 mRNA和蛋白的表達，且該作用呈時間和劑量依賴性。PANICHI等[21]的研究表明活性維生素D3具有抑制IL-1、IL-6及TNF-α等遞質的作用，從而能夠顯著減少系膜增生性腎小球腎炎大鼠模型的蛋白尿。由上可知，活性維生素D3具有阻抑慢性腎臟疾病進行性發展的潛能。本研究結果顯示，應用活性維生素D3干預治療后可以減少IgAN大鼠尿白蛋白排泄率，改善腎功能，減輕腎臟的病理改變，腎組織中TLR4的表達較模型組明顯下降，其炎性因子IL-1的表達同時間點較模型組有所下降。其作用機制可能是通過TLR4路徑抑制炎性因子的表達。因此，可以進一步以TLR4為靶點，阻斷或抑制其表達，觀察TLR4的具體變化，尋找表達變化中的關鍵環節，并針對關鍵因素進行臨床研究，可能為臨床藥物開發提供新的思路。

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（張立芳 編輯）

Effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on renal expression of TLR-4 in IgAN rats

Ying WANG,Guo-ping WANG,Bi-min LI
(Department of Nephrology,the First Affiliate Hospital of Nanchang University, Nanchang,Jiangxi 330006,P.R.China)

【Objective】To explore possible renal protective effect of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on IgAN rats.【Methods】Fifty rats were randomized into 3 groups,the normal control group(group NC)(n=10),IgAN group (group MC)(n=20),IgAN rats treated with 1,25-dihydroxyvitamin D3(Intervention group)(n=20).After 4 and 8 weeks treatment,24 h urine protein,serum creatinine and serum albumin were detected.ELISA was used to monitor the expressions of interleukin-1(IL-1)protein in plasma.Immunohistochemical staining was used to monitor the expressions of Toll-like receptor 4(TLR4)protein in renal tissue.【Results】①24 h urine protein and serum creatinine in the intervention group were significantly lower than those in the MC group(P<0.05);②TLR4 protein expression in MC group was significantly higher than that in NC group(P<0.05),and the expression in the intervention group was significantly lower than that in MC group(P<0.05);③IL-1 expression in the MC group was significantly higher than that in NC group(P<0.05);IL-1 expression in the intervention group was significantly lower than that in MC group(P<0.05).【Conclusion】1,25-dihydroxyvitamin D3 has some renal protective effect on IgAN rats, partly by down-regulating TLR4 in renal tissue.

IgAN;1,25-dihydroxyvitamin D3;Toll-like receptor 4;interleukin-1;rat

R-332；R692

A

1005-8982（2015）25-0025-05

2014-12-17

李弼民，E-mail：lbmjx@163.com