Th17細胞在支氣管哮喘小鼠發病機制中的作用研究

單世民，毛毅敏，孫瑜霞

（河南科技大學第一附屬醫院，河南 洛陽 471000）

·論著·

Th17細胞在支氣管哮喘小鼠發病機制中的作用研究

單世民，毛毅敏，孫瑜霞

（河南科技大學第一附屬醫院，河南 洛陽 471000）

目的研究Th17細胞及其分泌的炎癥因子（IL-17）在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用機制，并初步探討Th17和T-reg細胞的表達失衡的意義。方法將30只小鼠隨機分為對照組和模型組，采用卵白蛋白（OVA）致敏的方法建立小鼠哮喘模型。對兩組小鼠肺泡灌洗液（BALF）中炎癥細胞進行計數，并采用酶聯免疫吸附法檢測BALF中IL-17和IL-10水平；流式細胞術檢測小鼠外周血Th17和T-reg細胞占CD4+T淋巴細胞百分率情況；并分析Th17和T-reg細胞數與BALF中性粒細胞的相關性。結果哮喘組小鼠BALF中細胞總數和中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞百分率均明顯高于對照組（P＜0.05）。哮喘小鼠外周血Th17/T-reg細胞比例增大；BALF上清中IL-17水平明顯升高，而IL-10水平明顯降低（均P＜0.05）。Th17細胞數與BALF中的中性粒細胞數呈正相關，而T-reg細胞數與BALF中的中性粒細胞數呈負相關。結論Th17及其分泌的炎癥因子IL-17在哮喘小鼠氣道炎癥反應中有著重要作用，同時Th17/T-reg細胞在小鼠哮喘模型中失衡表達，提示其參與了哮喘的發病過程，為治療哮喘提供新的研究思路。

支氣管哮喘；Th17；IL-17；T-reg

支氣管哮喘是一種常見的慢性肺部疾病，其發病率和死亡率在我國逐年增高，但其發病機制尚不完全清楚。目前認為Th1/Th2細胞失衡導致Th2細胞占優勢是哮喘發病最重要的免疫學機制[1]，但近年來的一些實驗和臨床現象發現，Th1/Th2失衡理論并不能完全解釋哮喘的發病過程[2]。最近的研究表明Th17細胞作為一類新發現的輔助性T細胞，它在哮喘的發生及發展過程中具有重要的作用，而CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞（T-reg細胞）亦可能參與了哮喘的發生過程[3]。在Th17細胞分泌的多種細胞因子中，最重要的是白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17），而T-reg細胞分泌最常見的細胞因子是白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）[4]。本研究通過觀察哮喘小鼠模型中Th17細胞及其分泌的IL-17在小鼠體內的變化情況，初步探討Th17和T-reg的表達失衡在哮喘小鼠發病機制中的作用，為臨床治療提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器

卵蛋白（ovalbumin，OVA，美國Sigma公司），ELISA測定試劑盒（深圳晶美生物公司），RPMI 1640培養基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，抗小鼠單克隆抗體及其同型對照均購自美國BD/Pharmingen公司，酶標儀（美國PerkinElmer公司），流式細胞儀（美國R&D），光學顯微鏡（德國Leica公司），超聲波霧化器（WH 22000型，廣東粵華醫療器械廠有限公司）。

1.2動物分組及小鼠哮喘模型模型建立

實驗小鼠為SPF級雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重18～20 g，隨機將30只小鼠分為正常對照組和哮喘模型組，每組各15只。哮喘組于實驗開始當天和第8天分別給予腹腔內注射OVA混懸液（含OVA/Al（OH）3為10 mg/g），每次50μg，第16天開始給予霧化吸入含1%OVA的生理鹽水40 ml，40 min/d，連續7 d[3]。對照組以等量的生理鹽水代替OVA，觀察兩組小鼠反應和肺功能變化情況。

1.3支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的收集及制備

兩組小鼠在最后1次激發24 h后固定，處死小鼠并打開胸腔對小鼠行氣管插管，結扎左側主支氣管，用4℃磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）行支氣管肺泡灌洗3次，每次3 ml，回收率在80%以上為合格。對收集液進行離心（4℃，1 000 r/min，5 min）后取上清液，-80℃保存備用。將回收的BALF涂片，HE染色，在光學顯微鏡下對細胞總數和分類進行計數。

1.4外周血及BALF上清中IL-17和IL-10檢測

外周血通過摘眼球獲得，離心收集上清，-80℃保存備用。用ELISA檢測試劑盒測定外周血和BALF中IL-10和IL-17水平，具體步驟參照試劑盒說明書進行。

1.5流式細胞術檢測外周血Th17及細胞

外周血通過摘眼球采取，肝素化處理，加入適當的莫能菌素液，置于50 ml/L二氧化碳CO2、37℃孵育箱培養5 h，加入10μl相應抗體及其相匹配的同型對照，室溫避光孵育30 min，PBS洗2次，并用0.5 ml PBS重懸檢測，CellQuest軟件分析細胞數量情況。

1.6統計學方法

實驗結果以均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。組間比較分析采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義；相關性分析采用Pearson直線相關分析。

2 結果

2.1肺功能分析

與對照組相比，哮喘模型組小鼠先后出現咳嗽、氣急、呼吸頻率加快和毛發倒伏等癥狀，模型組小鼠吸氣阻力（inspiratory resistance，Ri）與呼氣阻力（expiratory resistance，Re）均明顯增加（P＜0.05），肺順應性下降。見表1。

表1 經OVA激發后兩組小鼠氣道阻力及肺順應性比較（[cmH2O·s）/ml±s]

表1 經OVA激發后兩組小鼠氣道阻力及肺順應性比較（[cmH2O·s）/ml±s]

注：?與對照組相比，P＜0.05

組別RiReCdyn對照組（n=15）1.8±0.13.5±1.60.16±0.02哮喘組（n=15）3.2±0.2?5.7±0.9?0.11±0.01?

2.2BALF中細胞計數和分類

哮喘組小鼠的BALF中細胞總數和各炎癥細胞的百分率均明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結果見表2。

2.3Th17細胞和T-reg細胞檢測結果

哮喘組小鼠外周血Th17細胞占CD4+T細胞百分比高于對照組，而T-reg細胞占CD4+T細胞百分比低于對照組（均P＜0.05）。哮喘組小鼠存在Th17/T-reg比例失衡，且比值明顯高于對照組（P＜0.05）。結果見表3與附圖。

附圖 對照組與模型組小鼠Th-17細胞和T-reg細胞所占比例（%）

表2 兩組小鼠BALF中細胞總數和細胞分類比較（n=15±s）

表2 兩組小鼠BALF中細胞總數和細胞分類比較（n=15±s）

注：?與對照組相比，P＜0.05

組別細胞總數/（×105個/ml）嗜酸性細胞/%中性粒細胞/%淋巴細胞/%對照組0.7±0.22.8±1.05.2±1.37.8±2.7哮喘組3.4±0.1?26.3±4.0?31.5±4.0?22.7±4.1?

表3 小鼠外周血TH17及Treg細胞占CD4+細胞的比率（±s）

表3 小鼠外周血TH17及Treg細胞占CD4+細胞的比率（±s）

注：?與對照組相比，P＜0.05

組別Th17細胞/%T-reg細胞/%Th17/T-reg對照組2.8±0.97.9±2.40.5±0.2哮喘組9.2±1.3?2.7±0.6?3.5±0.3?

2.4兩組小鼠BALF中IL-17與IL-10水平的檢測哮喘組BALF和血清中IL-17水平明顯升高，與正常對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。哮喘組BALF和血清中IL-10水平明顯下降，與正常對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表4。

表4 兩組小鼠肺泡灌洗液和血清中IL-10和IL-17水平（pg/ml±s）

表4 兩組小鼠肺泡灌洗液和血清中IL-10和IL-17水平（pg/ml±s）

注：?與對照組相比，P＜0.01

組別IL-10IL-17 BALF血清BALF血清對照組（n=8）108.1±13.1 131.4±3.55.3±0.35.8±0.8哮喘組（n=8）29.3±12.8?33.2±14.8?11.3±2.4?22.2±3.9?

2.5相關性分析

哮喘組小鼠外周血Th17細胞數與BALF中的中性粒細胞數呈正相關（r=0.421，P＜0.05），T-reg細胞數與BALF中的中性粒細胞數呈負相關（r= -0.533，P＜0.05）。

3 討論

支氣管哮喘是一種與免疫功能紊亂有關的慢性氣道炎癥性疾病，長期以來，Th1/Th2失衡理論在哮喘發病機制中占主導地位。近年來研究發現，Th17細胞是一種新型的不同于Th1和Th2，獨立分化和發育的另一種輔助性T細胞（Th17）亞群，與哮喘密切相關[5]。該細胞由天然T細胞前體Th0分化而來，在促炎癥反應和自身免疫性疾病中有著重要作用[6]。該細胞亞群能夠特異性地產生效應因子IL-17，而不產生干擾素-γ和IL-4。因此，被稱為Th17亞群[7]。Th1和Th2細胞因子能夠調控Th17細胞亞群的分化，IL-6和轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）聯合作用能誘導初始T細胞分化成Th17細胞[8]，這些機制表明Th17細胞在哮喘的發病中同樣具有一定作用。

Th17分泌的IL-17是T細胞誘導的炎癥反應的早期啟動因素，它是強大的促炎細胞因子，其主要的促炎機制是促進多種細胞（如上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞和基質細胞）釋放炎性（如IL-6、IL-8、粒細胞集落刺激因子以及前列腺素E2）而導致炎癥反應[9]。T-reg細胞的作用機制主要包括通過分泌細胞因子IL-10和TGF-β直接介導免疫抑制，其中，細胞因子IL-10具有抗炎作用，既可抑制促炎細胞因子的合成，亦可抑制嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞及肥大細胞的致炎，Foxp3是調控T-reg的標志性轉錄因子[10]。有研究表明，哮喘小鼠外周血中的T-reg細胞顯著低于正常小鼠[11]，與本實驗結果一致，而本實驗結果還顯示T-reg細胞所分泌的細胞因子IL-10水平低于正常小鼠。

本研究中，哮喘組小鼠BALF中細胞總數和中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等均明顯增高，以及Th17相關細胞因子IL-17的水平亦較正常對照組明顯升高，同時哮喘組小鼠外周血Th17細胞占CD4+T細胞的比例較對照組小鼠明顯升高，表明Th17及其分泌的炎癥因子參與了哮喘的發病過程。IL-17可增強IL-1及腫瘤壞死因子的功能，誘導IL-6及IL-8的產生，增強I-CAM-1在細胞表面的表達。因此，IL-17是T細胞調節中性粒細胞參與哮喘炎癥反應的中介；另外IL-17還具有上調黏液基因表達促進黏液分泌的作用，并可間接促進氣道組織纖維化而參與哮喘的氣道重塑過程。

本實驗還發現在哮喘小鼠中Th17細胞比例明顯高于正常組小鼠的同時，T-reg細胞比例則明顯減少，同時T-reg細胞所分泌的相關細胞因子IL-10也明顯降低，從而導致Th17/T-reg失衡，比值明顯升高，表明哮喘發生的過程可能與Th17/T-reg失衡導致的免疫紊亂有關。T-reg細胞數量減少、導致炎癥反應的功能降低，而Th17細胞過度表達，通過分泌IL-17誘導細胞因子和趨化因子的釋放而介導氣道炎癥，Th17/T-reg失衡這一新的機制有助于尋找新的治療哮喘的方法。

綜上所述，哮喘小鼠Th17細胞通過對哮喘氣道炎癥產生影響，促進氣道內中性粒細胞及嗜酸性粒細胞的聚集，從而在哮喘發病過程中發揮了重要作用，而Th17/T-reg的比例失衡彌補了Th1/Th2介導的效應機制的不足，提示Th17/Treg失衡可能在哮喘的發病機制中具有重要作用。

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（張立芳 編輯）

Roles of Th17 lymphocyte and its inflammatory cytokines in asthmatic mice

Shi-min SHAN,Yi-min MAO,Yu-xia SUN
(Department of Respiratory Medicine,First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan 471000,P.R.China)

【Objectives】To investigate the roles of Th17 cell and its inflammatory cytokines in the exacerbation of airway inflammation of murine asthmatic model,and to discuss the influence of imbalance expression of Th17/T-reg in asthmatic mice.【Methods】Thirty mice were randomized into two groups:control group and asthma group. The mice of asthma group were sensitized and challenged with ovalbumin(OVA).The mice of control group were given normal saline alone under the same conditions as the asthma group.We observed the changes of Th17 and T-reg cells in cellular proportion in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF)under a light microscope.And we detected the changes of Th17 and T-reg in cellular proportion in peripheral blood by flow cytometry method.The levels of IL-17 and IL-10 were detected by ELISA kits.A correlation analysis was done between Th17,T-reg and neutrophile granulocyte cells in the peripheral blood and neutrophils in BALF.【Results】The total cell number and the percentage of neutrophils,eosinophils and lymphocytes in BALF of the asthma mice were significantly higher than those of the control mice(P<0.05).The level of IL-17 in asthma group was significantly higher than that in the control group(P<0.05),and the level of IL-10 in asthma group was significantly lower than that in the control group(P<0.05).The expression of Th17 was positively correlated with the levels of neutrophils in BALF,and the expression of T-reg was negatively correlated with the levels of neutrophils in BALF.【Conclusion】Th17 cells could induce the asthma airway inflammation.And the imbalance expression of Th17/T-reg could play an important role in asthma pathogenesis.

asthma;Th17;IL-17;T-reg

R562.2；R-332

A

1005-8982（2015）25-0021-04

2014-12-17