間接免疫熒光法檢測幼兒呼吸道合胞病毒感染結(jié)果分析

吳春蘭 吳建芬

[文章編號] 1672-8270(2015)03-0070-04 [中圖分類號] R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A

間接免疫熒光法檢測幼兒呼吸道合胞病毒感染結(jié)果分析

吳春蘭①吳建芬②

[文章編號] 1672-8270(2015)03-0070-04 [中圖分類號] R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A

目的：分析間接免疫熒光法檢測呼吸道合胞病毒(RSV)感染結(jié)果，為本地區(qū)兒童感染RSV提供詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)。方法：采用間接免疫熒光法對2009-2010年化州地區(qū)急性呼吸道感染患兒的21 458份咽拭子樣本進(jìn)行檢測，分析RSV感染結(jié)果。結(jié)果：間接免疫熒光法檢測RSV感染，特異性以及敏感度均較高，與其他呼吸道病毒無交叉反應(yīng)。2009年共有臨床標(biāo)本10 477例，經(jīng)間接免疫熒光法檢測，RSV感染陽性檢測率為9.73%。RSV感染陽性檢測率有2個高峰，分別為每年的2月和12月，陽性率為11%。臨床中＜6歲的幼兒RSV的感染最高。結(jié)論：間接免疫熒光法具有檢測方便，特異性及敏感度高等優(yōu)點，可用于臨床對RSV感染的檢測。

間接免疫熒光法；呼吸道合胞病毒；感染

DOI∶ 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.03.023

[First-author’s address] Huazhou Maternity and Child Care Hospital, Huazhou 525100, China.

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)屬于單股負(fù)鏈RNA病毒，是臨床上誘發(fā)嬰幼兒下呼吸道感染的一種較為多見的病原體，全球各地均有過RSV感染的暴發(fā)[1]。以往臨床上對于RSV的診斷，多是通過發(fā)現(xiàn)敏感細(xì)胞系培養(yǎng)中存在特征性的致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)來確定。但其培養(yǎng)周期較長，且受到多種因素的感染，檢測結(jié)果的靈敏度并不高[2]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，目前多種新技術(shù)被用于臨床診斷RSV，而間接免疫熒光法是目前國內(nèi)外使用較多的一種檢測RSV的方法[3-4]。本研究采用間接免疫熒光法檢測RSV，并對2009-2010年化州地區(qū)急性吸道感染患兒的臨床標(biāo)本進(jìn)行RSV的檢測，旨在為本地區(qū)兒童感染RSV提供詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病毒株與標(biāo)本來源

(1)病毒株RSV由中國科學(xué)院武漢病毒研究所提供，為標(biāo)準(zhǔn)毒株Long株，其他急性吸道感染患兒的呼吸道病毒有A、B型流感病毒。

(2)對2009-2010年化州地區(qū)急性呼吸道感染患兒的21 458份鼻咽分泌物(nasopharyngeal secretions，NPS)樣本進(jìn)行檢測。患兒年齡均＜14歲，采集的標(biāo)本中放入含雙抗與兩性霉素的1640取材液中，并送至實驗室。

1.2 病毒分離及鑒定方法

在無菌條件下，將收集的標(biāo)本充分搗碎，使用離心機(jī)(1500 r/min)離心10 min，吸取上清液接種于傳代HeLa細(xì)胞管。每份標(biāo)本接種2管，采用Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)法，0.1 ml標(biāo)本上清液接種于Hep-2細(xì)胞，置于35℃溫箱中培養(yǎng)，以出現(xiàn)細(xì)胞病變?yōu)榕袛嗖《敬嬖诘闹笜?biāo)。2周后若未發(fā)生細(xì)胞病變者，再盲傳2代，若仍無細(xì)胞病變者則表明陰性結(jié)果。

1.3 NPS脫落細(xì)胞中RSV抗原快速檢測

(1)細(xì)胞涂片制備。將NPS置于2 ml的Hank's溶液內(nèi)，使用離心機(jī)(1500 r/min)離心10 min，棄上清液，留下少許液體。將沉渣制備成懸液，并涂在干凈的載玻片上，每份標(biāo)本分別涂在4張載玻片上，每片涂布4個小圓點，然后吹干，使用冷丙酮4 ℃下固定10 min，并置于干燥處備用。將RSV Long株感染的HeLa細(xì)胞以及未感染的HeLa細(xì)胞同時制備成陽性細(xì)胞涂片以及陰性細(xì)胞涂片，作為對照。

(2)免疫血清處理。HeLa細(xì)胞兔抗RSV血清，采用0.01M pH值為7.4的PBS將血清稀釋1倍，與HeLa細(xì)胞進(jìn)行混勻，使細(xì)胞最終濃度為6×106/ml。然后將樣本置于37 ℃水浴中1 h，并進(jìn)行間斷搖動。使用離心機(jī)(2500 r/min)離心10 min，收集上清液并放置于4℃的冰箱內(nèi)備用。作為研究對照的正常兔血清根據(jù)上述方法用HeLa細(xì)胞吸收。

(3)間接免疫熒光法檢測。NPS脫落細(xì)胞中RSV抗原檢測使用間接免疫熒光法進(jìn)行。一抗為兔抗RSV免疫血清(效價1∶80)，二抗分別為異硫氰酸熒光黃標(biāo)記的羊抗兔抗體(效價1∶20)以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體，底物使用3.3-二氨基聯(lián)苯胺。用間接免疫熒光法檢測RSV抗原均根據(jù)盲法進(jìn)行結(jié)果的判斷，以標(biāo)本中出現(xiàn)有2個以上的典型陽性細(xì)胞視為RSV抗原陽性。

(4)間接免疫熒光法檢測RSV抗原形態(tài)特征。RSV抗原陽性細(xì)胞漿或胞膜上出現(xiàn)有大小不等的顆粒狀果綠色熒光，有時呈星月狀熒光，有的胞漿全部呈現(xiàn)熒光。

2 結(jié)果

2.1 間接免疫熒光法特異性與靈敏度

(1)經(jīng)過檢測，發(fā)現(xiàn)RSV陽性標(biāo)本在建立的反應(yīng)體系中呈現(xiàn)較好的S型擴(kuò)增曲線，對其他呼吸道病原體陽性的標(biāo)本以及Hep-2細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性，未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

(2)經(jīng)過檢測，間接免疫熒光法檢測RSV的靈敏度為5 pfu。

2.2 RSV檢測結(jié)果

(1)2009年RSV感染情況分析。2009年全年共檢測標(biāo)本10 477份，其中RSV陽性標(biāo)本760份，檢測陽性率為7.25%。當(dāng)年有6個月的RSV感染率在7.0%以上，其中RSV感染的高峰期在3月，感染率達(dá)到20.04%。

(2)2010年RSV感染情況分析。2010年全年共檢測標(biāo)本10 981份，其中RSV陽性標(biāo)本1069份，檢測陽性率為9.73%。當(dāng)年有5個月的RSV感染率在7.0%以上，其中，RSV感染的高峰期在2月和12月，感染率分別達(dá)到29.56%和20.04%，如圖1所示。

圖1 2009年和2010年化州地區(qū)呼吸道合胞病毒感染檢測分布圖

(3)不同年齡階段RSV感染情況分析。2009年1069份RSV檢測陽性標(biāo)本中，1～6個月大的嬰幼兒RSV的臨床感染率最高，達(dá)到54.1%。＞3歲的兒童RSV感染率顯著降低，見表1。

表1 2010年1069例呼吸道合胞病毒感染年齡分布[例(%)]

3 討論

目前研究顯示，RSV是導(dǎo)致嬰幼兒急性下呼吸道感染的一個重要病毒病原，亦是造成流行性喘憋性肺炎發(fā)生的重要病原[5]。目前，采用單克隆抗體能夠?qū)SV具體區(qū)分為A、B兩種亞型。其中，A亞型患者疾病發(fā)生較急，病情較重；B亞型患者病情則相對較輕。目前研究發(fā)現(xiàn)，RSV包膜的表面存在兩種糖蛋白，分別是G蛋白以及F蛋白。前者主要具有吸附宿主細(xì)胞的能力，兩種蛋白均是RSV感染時較為重要的免疫原[6-7]。有研究認(rèn)為，RSV兩種亞型之間的抗原性以及氨基酸序列的差異性主要集中在G蛋白上，不同亞型之間的RSV G蛋白中的抗體，并不能提供有效的亞型間的交叉保護(hù)作用。因此，臨床研究中需要大量積累RSV以及其亞型流行病學(xué)的相關(guān)資料，明確RSV的流行趨勢以及致病特征，從而為RSV疫苗的開發(fā)及預(yù)防提供可靠的策略及依據(jù)。一般情況下，RSV接種到敏感細(xì)胞3～7 d后，就會發(fā)生細(xì)胞病變效應(yīng)。主要的特征是融合細(xì)胞組成更大的合胞體，并可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見到嗜酸性顆粒，能夠作為臨床診斷RSV感染的一個重要依據(jù)[8-9]。但是，隨著研究的深入，臨床發(fā)現(xiàn)上述方法驗證病毒是否復(fù)制需要的時間較長。對于臨床治療而言，隨著時間的延長，早期診斷、早期治療RSV的意義也會失去。

間接免疫熒光法是目前臨床上用于檢測病毒的一種新型方法，優(yōu)點在于對檢測病毒抗原較為敏感[10-11]。但是，間接免疫熒光法檢測時，可能在結(jié)果判定上存在主觀性，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。隨著臨床研究的深入，間接免疫熒光法亦得到一定的發(fā)展，已經(jīng)具有高靈敏度、高特異性以及高精確等優(yōu)點，避免了其他檢測技術(shù)的諸多問題[12-13]。此外，采用間接免疫熒光法技術(shù)，能夠在標(biāo)本獲取的當(dāng)天完成RSV的檢測，為臨床提供快速的實驗室診斷。通過實驗，說明建立間接免疫熒光法的特異性較好，與其他常見呼吸道病毒之間無交叉反應(yīng)。

通過對化州地區(qū)兩年的RSV感染監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)1-4月份屬于RSV較為活躍的時間，RSV流行的高峰往往出現(xiàn)在1-4月份，但是該結(jié)果并不是一定的，因為在2010年12月份也出現(xiàn)了一次RSV感染的流行。關(guān)于這一現(xiàn)象，以往的報道中較為少見，有學(xué)者報道，發(fā)現(xiàn)一些地區(qū)的RSV B亞型的G蛋白發(fā)生變異，而變異后的病毒促進(jìn)了RSV的流行。本研究中，12月份RSV的流行是否與G蛋白變異有關(guān)，尚有待臨床的進(jìn)一步研究[11]。目前研究發(fā)現(xiàn)，RSV是造成全球范圍內(nèi)兒童及成人呼吸道感染的重要病原，甚至是首要病原[12]。正如圖1所示，2009年全年有6個月的RSV感染率在7.0%以上，而2010年全年有5個月RSV感染率在7.0%以上，表明目前RSV的感染仍維持在一個較高的水平。本研究的結(jié)果顯示，在嬰幼兒的RSV感染中，＜6個月的嬰幼兒感染率最高，與一些文獻(xiàn)報告的結(jié)果相似[13]。隨著檢測技術(shù)的更新，使用間接免疫熒光法，可以更靈敏、更準(zhǔn)確的檢測病毒感染的情況，及時將結(jié)果反映到臨床，為疾病的診療提供可靠的實驗室支持。

綜上所述，間接免疫熒光法具有檢測方便。特異性及敏感度高等優(yōu)點，可以用于臨床對RSV感染的檢測。2009-2010年，RSV感染仍是化州地區(qū)兒童急性呼吸道感染的主要病原。

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Infection results analysis of immunofluorescence method detection of RSV

WU Chun-lan,WU Jian-fen// China Medical Equipment,2015,12(3)∶70-73.

Objective∶ To analyze the infection results of The immunofluorescence detection of respiratory syncytial virus (RSV) in huazhou region from 2009 to 2010. Methods∶ The N gene sequence of RSV was taken as a reference to design specific primers and TaqMan fluorescent probe and to establish real-time The immunofluorescence method to detect sensitivity and specificity.21548 swab samples of children with acute respiratory infections in huazhou region from 2009 to 2010 were tested with real-time fluorescence. The immunofluorescence method. Results∶ The specificity and sensitivity of real-time fluorescence. The immunofluorescence method for detection of RSV infection were higher, without cross-reactivity to other respiratory viruses.10,477 cases of clinical specimens in 2009 were detected, with positive RSV infection rate of 9.73%, by real-time The immunofluorescence method detection. Positive detection rate of RSV infection had two peaks, which lied in February and December; the positive rate was 11% and 11% respectively. RSV infection rate was the highest for children under 6 years old. Conclusion∶ Real-time fluorescence features convenient detection, high specificity, and high sensitivity, which can be used for clinical detection of RSV infection. From 2009 to 2010, RSV infection remains a major pathogen of acute respiratory infections in children in huazhou region.

Immunofluorescence method; Respiratory syncytial virus; Infection

吳春蘭,女,(1973- ),中專，主管技師。化州市婦幼保健院檢驗科，從事農(nóng)村基層檢驗研究工作。

2014-10-31

①化州市婦幼保健院檢驗科 廣東 化州 525100

②深圳市龍華人民醫(yī)院民治社康中心檢驗科 廣東 深圳 518131