臨床酵母樣真菌的系統鑒定及耐藥性研究

王洪曼 孫銘艷 王保強 陶元勇*

[文章編號] 1672-8270(2015)03-0067-04 [中圖分類號] R446.5 [文獻標識碼] A

臨床酵母樣真菌的系統鑒定及耐藥性研究

王洪曼①孫銘艷②王保強②陶元勇②*

[文章編號] 1672-8270(2015)03-0067-04 [中圖分類號] R446.5 [文獻標識碼] A

目的：通過對酵母樣真菌的系統鑒定，分析醫院酵母樣真菌感染情況及耐藥現狀，以指導臨床合理用藥，為減少真菌感染提供試驗依據。方法：將各種臨床標本分離培養后使用法國VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀、酵母菌鑒定卡及ATB Fungus 3藥敏板進行真菌鑒定和藥敏試驗。結果：共檢出院內酵母樣真菌感染210例，以假絲酵母菌為主(占97.14%)，其中白色假絲酵母菌140株(占66.67%)，熱帶假絲酵母菌30株(占14.29%)。對伊曲康唑的敏感率最低僅為53.3%，對氟康唑、伏立康唑、卡泊芬凈、5-氟胞嘧啶和米卡芬凈的耐藥率均＜7%，兩性霉素B耐藥率為0%。結論：假絲酵母菌是院內感染最常見的酵母樣真菌，耐藥性有增長趨勢，故應加強真菌的分離、鑒定以及耐藥性監測，以指導臨床合理選擇藥物。

酵母樣真菌；系統鑒定；耐藥性；阿薩希毛孢子菌

DOI∶ 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.03.022

[First-author’s address] Department of Laboratory Medicine, Weifang Medicine University, Weifang 261053, China.

真菌在自然界分布極為廣泛，且種類繁多，并寄生于人體皮膚和黏膜，屬于條件致病菌。近年來，由于廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、激素和免疫抑制劑在臨床的廣泛應用，器官移植及導管技術的開展以及艾滋病和糖尿病發病率的不斷上升，真菌感染的發病率呈上升趨勢[1]。目前，臨床上可用于抗真菌的藥物有限，而耐藥率也逐漸升高，并且出現二重感染。因此，加強真菌感染的控制及藥物監測，有效防治真菌二重感染及提高治愈率已成為目前臨床醫學領域中的一個重要課題。本研究收集臨床標本中分離到的真菌210株，對其臨床分布及耐藥情況進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集濰坊醫學院附屬醫院于2013年1-12月住院的患有慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、支氣管擴張及肺癌等肺部基礎病以及尿路感染、真菌性陰道炎及骨髓炎等患者標本和門診送檢的各類標本。入選患者1680例，其中男性875例，女性805例；年齡1～90歲，從中分離出酵母樣真菌210菌株，剔除相同部位的重復菌株。

1.2 設備與材料

(1)儀器與試劑。采用法國生物梅里埃公司生產的VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀、Bact/ ALERT 3D 120全自動血培養儀；使用哥倫比亞血瓊脂平板、沙保弱培養基、VITEK 2酵母菌鑒定卡YBC；酵母樣真菌藥敏試劑盒(微量稀釋法)ATB Fungus 3為法國梅里埃Biomerieux公司產品；卡泊芬凈、米卡芬凈等微量肉湯稀釋法藥敏試驗檢測板條由山東鑫科生物科技股份有限公司提供。

(2)培養基。使用改良SHADOMY瓊脂，適用于所有的抗真菌藥，主要成分包括酵母氮瓊脂基礎，葡萄糖和天冬氨酸，通過磷酸緩沖液控制二重感染，pH值為7.0。同時添加氯霉素控制細菌的污染。

(3)標準菌株質量控制。本研究所用白色念珠菌ATCC90028、近平滑念珠菌ATCC22019和克柔念珠菌ATCC6258均由衛生部臨床檢驗中心提供。

1.3 方法

(1)分離培養與鑒定。血液、腹水等無菌體液標本操作接種于培養瓶內，經Bact/ALERT 3D 120全自動血培養進行培養，陽性報警后涂片觀察并轉接種于沙保弱培養基上。痰液、尿液及分泌物等直接接種于沙保羅培養基、血平板上，放入35℃孵育箱培養18～24 h，通過菌落觀察和涂片進行初步鑒定。挑取培養基上單個酵母樣菌落，采用VITEK-2全自動微生物鑒定儀和酵母菌鑒定卡YBC對真菌種類作出鑒定。

(2)藥敏。利用酵母樣真菌藥敏試劑盒(微量稀釋法)ATB Fungus 3酵母樣真菌藥敏板條對210株菌株進行藥敏試驗，藥敏結果可通過肉眼判讀，或者應用ATB儀器判讀獲取MIC，按照美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)標準和ATB Fungus 3產品說明書的建議將菌株分為敏感、中介或耐藥。

(3)數據處理與分析。藥敏試驗結果應用WHONET 5.6專業軟件進行數據處理和分析。

2 結果

2.1 臨床標本來源及分布

酵母樣真菌感染患者的年齡分布在1～90歲，其中男性60例(占57.1%)，女性45例(占42.9%)；60歲以上的老年患者61例(占58.1%)。所分離出的210株酵母樣真菌分布在臨床各類標本中，其中主要來自痰液(占27.62%)、尿液(占16.19%)、咽拭子(占12.36%)、分泌物(占12.36%)和膿液(占10.48%)等標本，分離鑒定的210株酵母樣真菌以白假絲酵母菌為主，共140株(占66.67%)；其次是熱帶假絲酵母菌30株(占14.29%)；近平滑假絲酵母菌18株(占8.57%)，見表1。

2.2 藥物敏感試驗結果

對210株酵母樣真菌進行氟康唑、兩性霉素B、伏立康唑、卡泊芬凈、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑及米卡芬凈共7種藥物的敏感性實驗進行統計分析，發現所有真菌對兩性霉素B(100%)、米卡芬凈(99.0%)、卡泊芬凈(98.1%)、5-氟胞嘧啶(97.1%)敏感性最強，其次為伏立康唑(93.3%)、氟康唑(90.5%)，對伊曲康唑耐藥性最強，耐藥率為32.4%，見表2。

表1 210株酵母樣真菌分類及在不同標本中的分布(株)

表2 酵母樣真菌對抗真菌藥物的耐藥率[%(株)]

3 討論

近年來，隨著超廣譜抗生素、腎上腺皮質激素和免疫制劑等應用的增多，介入性治療手段的不斷開展，臨床真菌感染不斷上升，耐藥性也越來越強[2]。本研究顯示，在酵母樣真菌感染患者中， 標本類型主要是痰和尿液，分別占27.62%、16.19%，年齡＞60歲的患者占到58.1%，提示老年人呼吸系統易受到真菌的侵襲，其屬于特殊的易感人群，患有COPD、支氣管擴張及肺癌等肺部基礎病，而且長期臥床免疫力低下，抵抗力差，長期聯合應用廣譜抗菌藥物引起菌群失調、誘發真菌感染[3]。

在檢出的2 1 0株真菌中，白假絲酵母菌占66.67%，與李文波等[3]的報道結果相近，表明白假絲酵母菌在真菌感染中仍占主要地位，其原因是白假絲酵母菌的菌絲對人體的皮膚和黏膜等部位具有較強的粘附力，形成速度快，不易被吞噬，增強了白色念珠菌的致病性，而且白假絲酵母菌較容易形成生物膜，膜內的固著細胞較浮游細胞不易受抗真菌藥的影響而耐藥性增加[4-5]。本研究中菌株數量位于2、3位的是熱帶假絲酵母菌(14.29%)和近平滑假絲酵母菌(8.57%)。此外，還檢出了數種少見的酵母樣真菌，如羅倫隱球菌5例、阿薩希毛孢子菌1例、都柏林假絲酵母菌1例等。羅倫隱球菌屬非致病性腐生菌，只是在機體免疫功能受損，抵抗力下降時致病，通常起病隱襲進展緩慢檢出困難，臨床少見[6]。但在本研究中，羅倫隱球菌檢出率為2.38%，對伊曲康唑的耐藥率達到60.0%，應引起臨床注意。

阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii，T. asahii)是一種條件致病菌，廣泛存在于自然界中，國內首次分離鑒定見于楊蓉婭等[7]的研究報道，并與2012年5月完成標準株(CBS 2479)與環境株(CBS 8904)全基因組測序[8]。國外報道多發生于免疫功能低下如惡性腫瘤、惡性血液病、器官移植及HIV感染晚期的患者等，可引起系統性和致命性的感染[9-10]。近年來，在免疫正常人群也有該菌播散性感染的報道[11]。本研究分離的阿薩希毛孢子菌對卡泊芬凈、米卡芬凈等棘白菌素類藥物和5-氟胞嘧啶耐藥，對唑類藥物和兩性霉素B敏感與郭朝霞等[12]研究的體外藥物敏感試驗一致，可作為經驗用藥的參考，其耐藥機制有待進一步研究。

本研究顯示，210株酵母樣真菌對7種抗真菌藥物存在不同程度耐藥，其中兩性霉素B的敏感率為100.0%，其原因可能在于兩性霉素B毒性大，臨床應用較少。對卡泊芬凈、米卡芬凈的敏感率極高，耐藥率＜2.0%，該類抗真菌藥物是一類半合成環脂肽類物質，能非競爭性的抑制β-1，3-D-葡聚糖合成酶而阻止真菌細胞壁合成[13]。由于人體細胞無細胞壁、沒有β-1，3-D-葡聚糖合成酶這個作用靶點，此類藥物對人體細胞影響不大且安全性高。對氟康唑和伏立康唑的敏感度較高，其耐藥率均＜7.0%。伊曲康唑敏感性最低，僅為53.3%，其脂溶性高，是臨床上常用的藥物，但其服用后視覺障礙及皮膚反應較為常見，故不宜長時間服用，伊曲康唑的高耐藥率與臨床長期濫用抗真菌藥物有關，故氟康唑、卡泊芬凈可作為真菌治療的經驗用藥[14]。

臨床上出現真菌合并感染的情況不多見，一般都為單一真菌感染，在本研究中出現4例合并感染。據賀密會等[15]報道，合并感染的病死率較單一感染的高，故比單純感染危險性大，提示在發生真菌合并感染時，更要加強警惕，積極治療，以避免死亡的發生。

綜上所述，臨床微生物室應對送檢標本提高真菌的檢驗手段，準確地分離、鑒定，加強真菌的耐藥監測，供臨床醫師合理選擇抗真菌藥物。臨床醫師也要提高對真菌感染的認識，對有使用廣譜抗菌藥物、老年患者及ICU患者等免疫功能低下患者，要特別注意預防和監測，盡可能避免真菌引起的二重感染，以期達到正確治療和有效控制真菌感染的目的。

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Research on systematic identification and drug-resistant analysis of yeast-like fungus in clinic

WANG Hong-man, SUN Ming-yan, WANG Bao-qiang, et al// China Medical Equipment,2015,12(3)∶67-70.

Objective∶ Through the system identification of yeast-like fungus, analyze hospital infection and drug-resistant to guide clinical therapy, in order to reduce fungal infections provide the experimental basis. Methods∶ After the isolation and culture of various clinical specimens, tests of fungi identification and drug sensitive were performed by using VITEK 2 Compact Automated microbial identification system, Yeast identification card, ATB Fungus 3 fungal produced by the France BioMerieux company. Results∶ In 210 strains, yeast-like fungal infections were isolated, with Candida, accounting for 97.14%, of which a maximum of Candida albicans, 66.67%, followed by Candida tropical 14.29%. Sputum was detected fungi most, accounting for 27.62%, mainly in elderly patients. The Sensitive rate of itraconazole was lowest, only 53.3%, fluconazole, voriconazole, caspofungin, 5-fluorocytosine and micafungin resistance rates all lower than 7%, amphotericin B resistance rate was 0. Conclusion∶ Candida was the most common infection yeast-like fungi, there were increasing trend of drug resistance. It should strengthen the separation of fungus, identification and monitoring of drug resistance to guide clinical rational drug of choice.

Yeast-like fungus; Systematic identification; Drug-resistace; Trichosporon asahii

王洪曼,女,(1986- ),碩士研究生。濰坊醫學院醫學檢驗學系，研究方向：細菌及真菌分類鑒定與耐藥性。

2014-05-13

①濰坊醫學院醫學檢驗學系 山東 濰坊 261053

②濰坊醫學院附屬醫院檢驗科 山東 濰坊 261031

*通訊作者：taoyuanyong@163.com