不同中醫證型尖銳濕疣患者外周血及疣體組織中TLR3、TLR7 mRNA表達變化及意義

楊永茂，賈梅，楊桂蘭，沈敏娟，高雯

（1內蒙古巴彥淖爾市醫院，內蒙古巴彥淖爾 015000;2蘭州軍區蘭州總醫院;3吳江市第一人民醫院）

尖銳濕疣（CA）是由人乳頭瘤病毒（HPV）引起的外生殖器黏膜部位的增生性病變。大量研究［1］證明，CA的發生及轉歸與機體的免疫狀態關系密切。2006年6月～2008年7月，我們觀察了不同中醫證型CA外周血及疣體組織中Toll樣受體3（TLR3）、Toll樣受體7（TLR7）mRNA變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇蘭州軍區蘭州總醫院收治的CA患者 30例，男 19例，女 11例;年齡 20～50（32.40±5.62）歲;病程 3 ～6（3.89 ±1.25）個月。納入標準:CA臨床診斷明確（疣體典型，呈菜花樣、乳頭樣或雞冠樣），疣體≥黃豆大，1個或多個，醋酸白試驗陽性，年齡18～60歲，無其他系統性疾病或急慢性皮膚病，病史3個月以上，3周內未用其他治療CA的內服及外用藥物，女性患者排除懷孕、哺乳及月經期。中醫通過辯證論治分為Ⅰ型濕熱蘊結型（病程較短，表面潮紅，糜爛，滲液，伴心煩，口苦，小便黃，大便干結或不暢，舌質紅，苔黃膩，脈滑數）16例和Ⅱ型正虛邪戀型（病程較長，病情屢治屢發，久治不愈，伴神疲乏力，納呆，舌體胖淡，脈象沉細）14例。對符合上述入選標準者詳細記錄病史資料，行血常規檢查，然后自肘靜脈抽取血5 mL，加入肝素抗凝管1管（3 mL分離單個核細胞）;之后按常規切取100 mg的疣體組織，迅速置液氮中冷凍后轉存至-70℃冰箱保存。另選30例作為對照（C組，男性來自泌尿外科包皮環切患者，女性為美容手術者）。

1.2 外周血及疣體組織TLR3、TLR7 mRNA檢測在液氮中將疣體組織研磨呈細末狀，淋巴細胞分離液分離外周血單一核細胞。采用TRIzol試劑，按說明書操作提取總RNA。按試劑說明書操作逆轉錄合成 cDNA，-70℃保存備用。目的片段引物:TLR3:5＇-GGACTTTGAGGCGGGTGTT-3＇，5＇-TGTTGAACTGCATGATGTACCTTGA-3＇，141 bp;TLR7:5＇-TCTTCAACCAGACCTCTACATTCCA-3＇，5＇-GGAACATCCAGAGTGACATCACAG-3＇，172 bp;β-肌動蛋白:5＇-CCGCCATGTAGGTCGCTAT-3＇，5＇-TGACACGCCATCACCAG-3＇。標準品選用正常對cDNA梯度稀釋后獲得（將cDNA的梯度換算為拷貝數，進行倍比稀釋，即取10 μL cDNA加入90 μL雙蒸水，混勻，依次類推，共稀釋4個梯度）。實時熒光定量PCR檢測:25 μL反應體系中含有上下游各1 μL（20 pmol/L），熒光染料0.5 μL（20 pmol/L），Taq 酶 0.3 μL（5 U），dNTPs 1 μL及cDNA 1 μL（20 pmol/L）。程序為95℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環，最后72℃延伸1 min，用含有4個梯度濃度的cDNA制備成標準曲線對標本進行定量。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組外周血及疣體組織中TLR3、TLR7 mRNA比較見表1。

表1 各組外周血及疣體組織中TLR3、TLR7 mRNA比較（ ±s）

表1 各組外周血及疣體組織中TLR3、TLR7 mRNA比較（ ±s）

注:與 C 組比較，*P ＜0.05;與 B 組比較，△P ＜0.05。

TLR3 mRNA TLR7 mRNA組別 外周血 疣體組織A 組 2.85 ±0.23＊△ 3.06 ±0.21＊△ 2.49 ±0.13＊△ 2.71 ±0.14外周血 疣體組織＊△B 組 2.77 ±0.16* 2.96 ±0.19* 2.37 ±0.15* 2.74 ±0.16*C組1.45 ±0.31 1.78 ±1.19 1.50 ±0.29 1.87 ±1.43

3 討論

CA屬于中醫“臊瘊”的范疇，氣血不和，腠理不密，外邪侵襲，房事不潔，感受穢濁，邪毒與氣血相搏，凝聚肌膚而成。如果未及時治療或治療不當，濕邪蘊久困脾，脾虛濕濁下注，釀濕生熱，濕熱交結，而致正氣虧虛，不能驅邪外出，導致病程纏綿遷延，反復發作而又難以治愈。因此，將CA分為濕熱蘊結型和正虛邪戀型來研究，符合 CA的發病機理［2，3］。CA患者感染HPV后宿主與病毒之間的相互較量最終決定病情的發展，TLR受體在免疫方面起重要作用，在CA患者存在TLR3和TLR7的高表達現象，通過與健康者比較，CA患者顯著偏高，濕熱型較正虛邪戀偏高，提示中醫不同證型之間在微觀方面有不同的變化，符合中醫的辯證分型。

TLR受體是近年來發現的重要天然識別受體［4，5］，是一類重要的模式識別受體，在固有免疫和適應性免疫中發揮重要作用，在人類已發現至少12個家族成員，廣泛分布在單核細胞、T細胞、血管內皮細胞、消化道上皮細胞、脂肪細胞、心肌細胞等細胞表面，與病毒識別有關的有 TLR3、TLR7、TLR8、TLR9，當病原微生物入侵時，機體通過識別外源性微生物的侵入，并激活免疫反應清除外來微生物［6～9］。TLR是迄今認識的第一組機體通過感知病原體直接作出防御反應的天然免疫受體，在先天性免疫激活及其與獲得性免疫之間的信號傳導中起重要作用，尤其在識別微生物時起關鍵作用，如TLR3能夠識別雙鏈RNA病毒，TLR7能識別單鏈RNA病毒［10］。機體的免疫反應包括兩種機制，一種是由巨噬細胞和樹突細胞（DC）承擔的先天性免疫，另一種是由T、B細胞承擔的獲得性免疫。在病毒感染中，先天性免疫發揮著極其重要的防御作用。TLR能直接活化抗微生物應急防御系統，合成和分泌Ⅰ型干擾素，而Ⅰ型干擾素是目前抗病毒治療的主要措施［7，11］。抗病毒藥鳥苷類似物及免疫調節劑就是能通過TLR7激活DC，誘導不同的炎癥性誘導因子產生，在臨床上用來治療包括CA在內的多種病毒性皮膚病。治療CA的常用藥物咪喹莫特就是通過TLR7介導Ⅰ型干擾素的生成，連接先天免疫和適應性免疫，從而發揮抗病毒效應［12，13］。

本研究顯示，CA患者外周血及組織中TLR3、TLR7 mRNA均高于健康對照者，且濕熱蘊結型高于正虛邪戀型，提示CA患者與健康人群比較，Toll受體積極參與人體免疫系統清除病毒;不同證型之間比較更進一步說明整體觀的重要性，用微觀的理論佐證宏觀的辯證論治，也為CA中醫辨證分型的客觀化、微觀化提供了理論依據，為CA發病機理方面提供了參考資料。

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