羥基苯甲腈類抑制劑與Cdc25B磷酸酯酶相互作用的結合位點殘基觀察

王喆，趙宏濤

（天津醫科大學第二醫院，天津 300211）

Cdc25磷酸酯酶屬于雙特異性蛋白磷酸酶，在細胞周期中發揮重要作用，可將細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）去磷酸化，從而使其激活［1］。Cdc25磷酸酯酶包括Cdc25A、Cdc25B和Cdc25C三種亞型［2］，其中Cdc25B可以與CDK2/Cyclin A復合物結合，水解CDK2中ATP結合位點loop上兩殘基的磷酸根，進而將其激活［3］。Cdc25B在多種腫瘤細胞如結腸癌、胰腺癌、卵巢癌等過度表達，對腫瘤細胞的發展起促進作用，下調Cdc25B表達會引起腫瘤細胞周期阻滯，抑制腫瘤細胞增殖。因此，Cdc25B已經成為治療癌癥的潛在藥物作用靶點［4，5］。傳統的設計思路是針對Cdc25B的催化活性位點設計抑制劑，但該位點空間體積較小，導致小分子抑制劑設計難度增加。最近研究［6］報道了新型羥基苯甲腈類Cdc25B抑制劑，此類抑制劑并不與Cdc25B催化活性位點結合，而是作用于Cdc25B與CDK2/Cyclin A復合物的結合位點，從而抑制Cdc25B酶活性。目前對Cdc25B中專門負責識別羥基苯甲腈類抑制劑殘基的認識還十分有限，本研究利用分子動力學模擬的方法確定了羥基苯甲腈類抑制劑與Cdc25B磷酸酯酶相互作用的結合位點殘基。

1 材料與方法

1.1 Cdc25B蛋白及其結構預處理 從RCSB蛋白數據庫下載人Cdc25B/A8H（PDB編號:4WH7）和Cdc25B/3M8（PDB編號:4WH9）復合物晶體結構，去除晶體結構中的硫酸根離子和甘油分子，只保留小分子抑制劑周圍0.4 nm范圍內的結構水分子。

1.2 A8H、3M8與Cdc25B磷酸酯酶相互作用的分子動力學模擬參數設置 分子動力學模擬所用軟件為 Gromacs 4.5.5，蛋白采用 Amber FF99SB 力場［7］，小分子抑制劑采用GAFF（General Amber Force Field）［8］，通過量子化學半經驗AM1方法對小分子抑制劑進行結構優化，并利用AM1-BCC方法擬合出小分子抑制劑原子的局部電荷。在進行分子動力學模擬前，先將兩個蛋白/抑制劑復合物晶體結構置于TIP3P水盒子中，水盒子邊緣到最近的溶質原子的距離為1.0 nm。此外，模擬使用周期邊界條件，利用PME（Particle Mesh Ewald）方法校正長程靜電作用，使用LINCS算法限制連有氫原子化學鍵的鍵長，分子動力學模擬所用范德華作用閾值為1.0 nm，模擬溫度設定為300 K，恒溫模擬算法為Velocity Rescaling［9］。分子動力學模擬積分步長為1.0 fs，每隔10 ps保存1次軌跡。在進行分子動力學平衡前，對兩個蛋白/抑制劑復合物結構進行最速下降法優化，直到體系原子所受力最大值不超過1 000 kJ/（mol·nm2）。為平衡溶劑水分子，在恒溫恒容條件下，給兩個蛋白/抑制劑復合物重原子加1 000 kJ/（mol·nm2）的限制力進行100 ps分子動力學模擬。然后去掉該限制力，在恒溫恒容條件下進行1 ns分子動力學平衡過程以及10 ns正式分子動力學模擬。

1.3 Cdc25B/羥基苯甲腈類抑制劑復合物的穩定性觀察 為研究Cdc25B/抑制劑復合物在分子動力學模擬過程中的穩定性，本研究以10 ns正式分子動力學模擬的起始結構為參照，計算了Cdc25B/A8H和Cdc25B/3M8復合物蛋白骨架Cα原子均方根偏差（RMSD）隨時間變化的曲線。各體系RMSD數值在5 ns后基本在0.15～0.2 nm范圍內波動，上述各體系在5 ns后達到分子動力學模擬的平衡狀態，分子動力學模擬產生的后5 ns軌跡可以用于進一步的氫鍵作用和相互作用能分析。

1.5 A8H、3M8與CDC25B結合位點殘基相互作用能計算方法 根據Amber力場計算公式［12］，計算小分子抑制劑（A8H和3M8）與CDC25B活性位點殘基的靜電相互作用能和范德華相互作用能，A8H、3M8與殘基之間的總相互作用能為靜電相互作用能和范德華相互作用能之和，相互作用能計算所使用的軌跡與氫鍵作用分析相同。

2 結果

2.1 A8H、3M8與Cdc25B結合位點殘基的氫鍵作用 A8H與Cdc25B結合位點各殘基Y382、D397、K399、R485、R488、R492 形成氫鍵的概率分別為 0、2.00%、0.40%、0.60%、0、0，3M8 與 Cdc25B 結合位點各殘基 Y382、D397、K399、R485、R488、R492 形成氫鍵的概率分別為 11.38%、12.97%、0.80%、4.19%、94.41%、97.21%。3M8 的磺酸根可以與R488、R492側鏈的胍基以及Y382側鏈的酚羥基形成氫鍵作用，3M8的酚羥基與D397側鏈的羧基形成氫鍵作用，其中3M8與Y382、D397之間的氫鍵作用是不能從晶體結構看到的。

2.2 A8H、3M8與Cdc25B結合位點殘基的相互作用能 D397、L398、C484、R485、R488、M505 與 A8H形成了較強相互作用，Y382、D397、L398、C484、R485、R488、R492、M505 與 A8H 形成了較強相互作用，詳見圖1。

3 討論

圖1 A8H、3M8與Cdc25B結合位點殘基相互作用能

確定生物大分子中參與配體分子識別的殘基，是進行基于結構藥物設計的基礎。雖然Lund等［6］通過X射線晶體結構，發現了Cdc25B中對R488和R492的識別作用，但是Cdc25B對抑制劑的識別是一個動態的過程，其他一些極性殘基也在這兩個殘基附近，在動態的分子識別過程中，它們也可能與小分子抑制劑形成強極性相互作用，從而參與該類抑制劑的識別。除了極性作用，非極性作用也是分子識別的關鍵。由于羥基苯甲腈類抑制劑具有像苯環這樣的芳香基團，推測Cdc25B中某些疏水殘基在該類抑制劑的識別過程中同樣發揮重要作用。單純觀察蛋白/抑制劑復合物晶體結構，很難發現哪些疏水殘基參與了抑制劑的識別。相比靜態蛋白晶體結構，分子動力學方法可以通過計算，模擬出Cdc25B與羥基苯甲腈類抑制劑之間的動態相互作用情況，并在此基礎上，通過分析氫鍵作用概率和相互作用能，確定參與抑制劑識別的殘基。

氫鍵作用是蛋白對小分子進行識別的主要方式之一，在氫鍵作用分析中，本研究計算了小分子抑制劑與Cdc25B結合位點殘基氫鍵作用概率，那些與A8H或3M8形成穩定氫鍵作用的殘基被認為參與了Cdc25B對此類小分子抑制劑的生物識別。本研究結果表明，Y382、D397、R488和R492可以通過氫鍵作用方式，幫助Cdc25B識別羥基苯甲腈類小分子抑制劑。由于氫鍵作用分析只是在一定程度反映了小分子抑制劑與Cdc25B結合位點殘基之間靜電作用強度的差異，不能反映非極性的范德華相互作用大小。為進一步研究Cdc25B結合位點殘基對該類小分子抑制劑的識別機制，就需要了解Cdc25B結合位點殘基與這兩個小分子抑制劑之間的相互作用強度?？紤]到這兩個抑制劑都占據了Cdc25B相同的區域，兩個小分子抑制劑A8H和3M8與這些殘基的相互作用強度無法通過分析晶體結構來判斷。為進一步研究Cdc25B結合位點殘基與小分子抑制劑的相互作用，就必須計算Cdc25B結合位點殘基與這兩種小分子抑制劑的相互作用能。本研究結果表明，Y382、D397、L398、C484、R485、R488、R492、M505參與了Cdc25B對羥基苯甲腈類抑制劑的識別作用。

綜上，本研究利用分子動力學模擬的方法，通過分析Cdc25B與羥基苯甲腈類抑制劑之間氫鍵作用概率和相互作用能，發現 R488和 R492參與了Cdc25B對羥基苯甲腈類抑制劑的識別，這與既往研究［6］結果相吻合。在此基礎上，本研究還發現Y382、D397、L398、C484、R485 和 M505 同樣參與了Cdc25B對羥基苯甲腈類抑制劑的識別。因此，研究人員在設計Cdc25B抑制劑時，需要注意調控小分子化合物與這些殘基之間的相互作用。

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