雙醋瑞因對大白兔肥厚黃韌帶作用機制的病理免疫組化研究

吳方云

黃韌帶肥厚是脊椎退行性變過程中的一種病理表現，常與椎間盤突出、椎板及小關節增生肥大并存［1］。黃韌帶肥厚可達 7～15 mm，多伴有不同程度的鈣化和骨化，骨化后的黃韌帶與椎板常融合成一整塊骨板，使椎板增厚可達30 mm以上。黃韌帶肥厚骨化可使椎管矢狀徑變小，產生椎管狹窄癥［2］。黃韌帶退變肥厚的過程中有 IL－1、IL－6、TNF－α 和TGF－β1的共同參與，且誘導或促進了退變肥厚。雙醋瑞因是一種新的白介素（IL）－1抑制藥，主要用于治療骨性關節炎，有效率在 72.0%～83.3%。 國內研究顯示，本品可顯著改善骨性關節炎及相關疾病引起的疼痛和關節功能障礙等癥狀，作為一種治療骨性關節炎的口服藥物，不僅能緩解癥狀，而且能真正緩解疾病進程，是骨性關節炎治療上的重大進步。相關研究指出，雙醋瑞因應該能對黃韌帶的退變肥厚過程起到一定作用［3］。本研究應用雙醋瑞因作用于黃韌帶退變肥厚過程，從分子生物學角度來闡述作用機制，可以針對黃韌帶肥厚造成的椎管狹窄癥患者治療提供一種新的非手術的治療方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 本次研究采用的實驗動物為新西蘭大白兔，雄性，體質量 1.8～2.2 kg，購自濟南西嶺角養殖繁育中心，動物合格證號為：20100005。造模成功的大白兔共90只，另外45只為正常大白兔。雙醋瑞因由山東中醫藥大學附屬醫院提供。

1.2 方法 模型建立采用筆者先前的方法［4］，將造模成功動物分為模型組與藥物組；模型組以生理鹽水灌胃，藥物組為雙醋瑞因灌胃，劑量為3.8 mg/kg，連續干預3個月。另外選擇45只同齡的清潔級新西蘭大白兔45只作為正常組，正常組不造模，同藥物組一樣采用生理鹽水灌胃，其余操作同模型組。于第4、8和12周，各組隨機處死動物至少15只，取黃韌帶，10%中性甲醛液固定。用光學顯微鏡觀察三組免疫組化切片中IL－1、IL－6及TNF－α的表達情況，具體評分標準見表1。

表1 IL－1、IL－6 和 TNF－α 染色結果評分標準

1.3 統計學處理 采用 SPSS20.0版統計軟件，率的比較采用的是χ2檢驗，檢驗的標準定為α＝0.05。

2 結 果

模型組與藥物組中黃韌帶細胞質或細胞核中IL－1、IL－6、TNF－α 的表達明顯高于正常組，有統計學意義。藥物組的 IL－1、IL－6、TNF－α 表達陽性率顯著低于模型組，有統計學意義。見表2、3、4。

表2 兔黃韌帶組織中的IL－1表達情況比較

表3 兔黃韌帶組織中的IL－6表達情況比較表

表4 兔黃韌帶組織中的TNF－α表達情況比較表

3 討 論

黃韌帶增厚也稱為黃韌帶肥厚。在腰痛或腰腿痛患者中，經造影檢查或手術治療中多觀察到有黃韌帶增厚者。有研究指出，該韌帶的彈力纖維的退行性改變所導致的纖維結締組織增殖是其病理基礎，其與脊柱的損傷和骨關節的退行性改變有密切的聯系。臨床還見到只有該韌帶增生，而未見有骨結構改變者。但無論是單獨發生或是共同發生，均將導致椎管的矢狀徑縮小，并因此而導致繼發性椎管狹窄癥的臨床癥狀［5］。

黃韌帶過度增厚，使該處的神經根極易受到壓迫，馬尾神經即容易受到擠壓，因而引起腰痛、下肢疼痛、無力、大小便障礙，出現椎管狹窄及神經根的壓迫癥狀。通常發生在腰4、5椎板之間。黃韌帶肥厚造成的椎管狹窄癥屬于軟組織性狹窄，可采用針刀治療；黃韌帶骨化造成的椎管狹窄癥則屬于骨性狹窄，又能選擇手術治療，可采取手術切除黃韌帶，來解除神經根的壓迫癥狀。

雙醋瑞因是一種IL－1抑制藥，主要是通過抑制IL－1的活性而發揮作用，但不影響前列腺素的合成，是治療骨關節炎的另一種有效的藥物。臨床研究表明，雙醋瑞因可顯著緩解骨關節炎的癥狀，修正骨關節的結構，屬于改變骨關節炎癥狀和病情的慢作用藥物［6］。

雙醋瑞因在骨關節炎動物模型也顯示了對軟骨的短期和長期的明顯保護作用，降低了骨關節炎常見的軟骨、骨及滑膜損傷的發生率和嚴重程度，除輕度腹瀉外未見其他靶器官的損害［7］。體內外實驗也未發現任何生殖毒性、致癌性，對動物的生殖力、圍生期毒性和致畸胎研究結果均顯示了雙醋瑞因的安全性［8］。本品為骨關節炎IL－1的重要抑制藥，屬小分子蒽醌類大黃屬二乙酰衍生物。在動物和人體內，口服本品在進人體循環前經脫乙酰基作用生成活性代謝產物大黃酸。健康成人單次口服給藥達峰時間約為2.4 h，血漿蛋白結合率＞99%，血漿半衰期約為4.2 h，本品表觀生物利用度為35%～56%。代謝產物大黃酸主要經腎排泄，小部分也經膽汁排泄。

夏光濤［9］認為，骨關節炎（OA）是導致老年人行動障礙的最常見原因之一，臨床尚缺乏相關特異性藥物治療方案。OA治療新藥雙醋瑞因可改善軟骨代謝，有望延緩或逆轉OA疾病進程，提高臨床OA治療水平。馮建華［10］為了觀察雙醋瑞因治療骨關節炎的臨床療效，選用雙醋瑞因組50 mg/d，美洛昔康組15 mg/d，1個月為1個療程，持續1～3個療程，隨訪1～3個月。經1個療程治療，有效率分別是 62.22%和68.33%，3個療程后， 有效率分別是84.44%和71.67%。雙醋瑞因組和對照組在主要療效指標（步行痛、上下樓梯痛）和次要療效指標（關節壓痛）均較治療前明顯改善，但對照組隨訪期與治療結束時相比，步行痛、上下樓梯痛和關節壓痛程度有所加重。在觀察期間，雙醋瑞因出現不良反應約為5%，主要為輕度腹瀉及腹部輕微疼痛，持續治療后絕大多數可自行消失，美洛昔康組出現不良反應約為6%，主要為胃腸道反應，如惡心、嘔吐等，停用后可消失。由此得出結論，應用雙醋瑞因治療膝骨關節炎療效肯定，而且雙醋瑞因的作用持久，無嚴重不良反應發生，安全性好。

程堅［11］通過試驗探究藥物雙醋瑞因治療膝骨關節炎的臨床效果及安全。隨機選取2010年5月—2012年5月患有膝骨關節炎癥狀的中老年患者90例，將90例患者隨機分為對照組與藥物組。藥物組患者給予雙醋瑞因膠囊治療，對照組患者給予硫酸氨基葡萄糖膠囊治療。結果藥物組患者在其第14周與第 18 周的治愈率為 93.33%（42/45）與 88.88%（40/45）。對照組患者在其第14周與第18周的治愈率為 82.22%（37/45）與 77.77%（35/45）。 藥物組治愈率明顯高于對照組。因此，采用雙醋瑞因治療中老年人膝骨關節炎。可以有效地恢復中老年人患者的關節功能，清除患者骨內炎癥，使患者的關節炎得到有效治愈。

王霖［12］考察雙醋瑞因對破骨細胞生成及骨破壞功能是否具有抑制作用，以及雙醋瑞因抑制破骨細胞的作用是否與影響成骨細胞中OPG及RANKL的表達有關。應用Western blotting法、流式細胞術及RT2PCR法在蛋白水平及基因水平觀察MC3T32E1細胞中RANKL及OPG的表達。雙醋瑞因可在基因及蛋白水平上調MC3T32T1細胞中OPG/RANKL的比例。由此得出了結論，雙醋瑞因具有抑制IL21β誘導的破骨細胞性骨破壞的作用，這一作用可能與其抑制MC3T32E1細胞中RANKL表達同時促進OPG表達有關。

綜上所述，雙醋瑞因對局部組織的炎癥因子起到了改善作用，通過雙醋瑞因的藥物干預，肥厚黃韌帶中膠原纖維增生明顯受到抑制，從而改善肥厚黃韌帶中的組織結構，使之恢復至正常狀態或接近正常狀態。

［1］蔣玉權.腰椎黃韌帶肥厚的生化與力學機制研究進展［J］.臨床骨科雜志，2009，12（4）：454－456.

［2］陳國陽，陳永旺，張清平，等.雙醋瑞因膠囊治療膝骨關節炎臨床觀察［J］.吉林醫學，2013，34（l2）：2264－2265.

［3］ Altinkaya N，Yildirim T，Demir S，et al.Factors associated with the thickness of the ligamentum flavum：is ligamentum flavum thickening due to hypertrophyor buckling？ ［J］.Spine（Phila Pa 1976），2011，36（16）：1093－1097.

［4］李學朋.雙醋瑞因對黃韌帶肥厚大白兔血清炎癥因子調節及肥厚黃韌帶病理結構的影響［J］.中醫正骨，2014，26（2）：8－10.

［5］ Cui G，Watanabe K，Miyauchi Y，et al.Matrix metalloproteinase 13 in the ligamentum flavum from lumbar spinal canal stenosis patients with and without diabetes mellitus［J］.J Orthop Sci，2011，16（6）：785－790.

［6］ 寧金沛.黃韌帶肥厚機制研究進展［J］.醫學綜述，2012，18（6）：896－897.

［7］ Zhou H，Dong G，Huang H，et al.MRI finding of the lumbar foraminal stenosis and its clinical signifincance［J］.Zhong guo Gu Shang，2010，23（8）：587－590.

［8］ Chen YT，Wei JD，Wang JP，et al.Isolation of mesenchymal stem cells from human ligamentum flavum：Implicating etiology of ligamentum flavum hypertrophy［J］.Spine（Phila Pa 1976），2011，36（18）：1193－1200.

［9］夏光濤，戶中丹，李 璐，等.雙醋瑞因治療骨關節炎的臨床研究進展［J］.世界臨床藥物，2010，31（8）：460－463.

［10］馮建華.雙醋瑞因治療骨關節炎的90例臨床觀察［J］.醫學信息，2011，10（9）：4384.

［11］程 堅.雙醋瑞因治療膝骨關節炎的療效及安全性分析［J］.海峽藥學，2012，24（10）：205－207.

［12］王 霖，毛昱嘉，王文杰.雙醋瑞因對破骨細胞性骨破壞的抑制作用及機制［J］.藥學學報，2006，41（6）：555－560.