含人干細胞白血病基因的重組慢病毒表達載體的構建及鑒定

于建超，王江平，李應龍，錢彪，倪釗，王新敏，李強，王文曉，王勤章

(1石河子大學醫學院，新疆石河子832000;2石河子大學醫學院附屬第一醫院)

糖尿病膀胱異常病癥(DCP)為糖尿病末期常見的并發癥之一，發生率為19%～84%;其臨床表現為遺尿、尿不凈等，末期會出現尿路感染、腎炎等，最終發展成尿毒癥，發生機制目前尚不明確［1］。近年研究發現，膀胱逼尿肌會出現自發性收縮，此收縮完全受到Cajal樣細胞的調節［2］。DCP患者受高血糖的誘導，其Cajal樣細胞不斷萎縮或消失，致使Cajal樣細胞出現非特異性變異，導致干細胞因子(SCF)/c-kit信號表達功能減弱，膀胱感覺降低、收縮性減弱，膀胱剩余尿量增加等，最終導致DCP發生［3～8］。研究發現，干細胞白血病基因(SCL)屬于c-kit上端必不可少的調控基因，能夠有序開啟c-kit基因表達，促進Cajal樣細胞表型及功能恢復［9～13］。重組慢病毒載體可發揮自主整合作用，以此在主細胞基因鏈中實現寄宿，在促進主細胞分裂增殖的同時表達目的基因。本研究通過基因工程技術，構建含人SCL基因的重組慢病毒表達載體(GV287-SCL)，旨在為DCP的基因治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 含有SCL基因質粒的綠色熒光蛋白(GFP)購自意大利瑞德基因研究所，感受態大腸桿菌DH5α、293T細胞、GV287-EGFP載體購自南京祥瑞基因公司，DMEM、FBS、轉染試劑盒 Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA片段提純試劑盒與DNA提取試劑盒購自日本QLAGEN生物研究中心，RTPCR試劑盒購自上海吉凱基因化學技術有限公司，SDS-PAGE蛋白電泳儀及蛋白轉膜儀購自南京天能生物研究公司。

1.2 人SCL基因擴增 對人SCL基因質粒進行PCR 擴增，上游引物:5＇-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGACCGAGCGGCCGCCGAG-3＇，下 游引物:5＇-TCACCATGGTGGCGACCGGCCGAGGGCCGGCTCCATC-3＇，由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。反應條件:94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30個循環;72℃延伸10 min。取10 μL PCR反應產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 穿梭質粒GV287-EGFP/SCL的設計 提純包括人SCL基因的PCR擴增因子，通過In-Fusion轉換酶的催化將靶基因的PCR產物與GV287-EGFP線性化載體進行結合。

1.4 重組質粒GV287-EGFP/SCL的篩選與鑒定提取含有人SCL基因的GV287-EGFP質粒陽性克隆菌落PCR模板上的交換轉化產物，長出菌落后加入10 μL培養基混勻。取1 μL設置模板，PCR法擴增基因。上游引物:5＇-GGTATAAGAGGCGCGACCAG-3＇;下游引物:5＇-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3＇。反應條件:94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環;72℃延伸6 min。取10 μL PCR反應產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。與陽性轉化子對接，分裝，進行排序測定。抽選8個轉化子，通過SCL引物對其進行PCR檢測，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.5 重組慢病毒GV287-SCL的包裝、培養及鑒定培養293T細胞株作為包裝細胞，取1.5 mL滅菌EP 管，加入 1.5 μg 包裝質粒和 0.5 μg 表達質粒以及250 μL無血清培養基，混勻后室溫下孵育5 min;將9 μL 脂質體、250 μL 無血清培養基置于1.5 mL EP試管中，輕輕震蕩混合，室溫下孵育5 min。將上述含DNA的溶液與脂質體液均勻搖擺混合，室溫下孵育20 min。采用胰蛋白酶消化293T細胞并計數，置于有血清的培養液中。將上述 DNA、脂質體混合物置于6孔培養板，給予1 mL含血清培養基培養。將1 mL 293T細胞懸掛，并置于6孔培養板，37℃CO2孵箱里孵化48～72 h，3 000 r/min離心20 min，過濾沉淀物，通過PVDF過濾膜篩選慢病毒原液。對含有病毒的血清進行梯度稀釋分組(1∶100)，將其分為標準液與待測液，將兩種液體同時感染293T細胞，采用熒光標記法計算病毒滴度［8］;提取293T細胞蛋白，采用Western blotting法檢測目的基因。

2 結果

2.1 人SCL基因擴增產物鑒定 PCR產物大小為1 036 bp，與目的基因相關片段中SCL cDNA大小相同，見圖1。

圖1 人SCL基因的擴增PCR產物電泳圖

2.2 重組質粒GV287-EGFP/SCL陽性克隆鑒定陽性轉化子通過擴展后，均形成503 bp條帶，其大小與目的片段人SCL cDNA相當;陰性轉化子得到192 bp條帶;見圖2。重組質粒 GV287-EGFP/SCL陽性克隆測序結果顯示，目的基因SCL成功插入到GV287-EGFP，基因排序與GenBank信息庫里的人SCL基因mRNA基本相同。

2.3 重組慢病毒GV287-SCL鑒定及病毒滴度確定 重組慢病毒GV287-SCL作用293T細胞1天即觀察到細胞核內出現GFP表達。提取蛋白，采用Western blotting法檢測到72 kD附近出現特征條帶，其大小與SCL-GFP融合蛋白基本吻合。重組慢病毒在多次感染、外擴和提純之后，滴度為5×108TU/mL。

圖2 重組質粒GV287-EGFP/SCL陽性克隆電泳圖

3 討論

Cajal樣間質細胞控制膀胱逼尿肌的自發性興奮與收縮，屬于實際上的起搏介質。Cajal樣間質細胞的表達與其特異性酪氨酸激酶受體c-kit密切相關，通過對SCF/c-kit信號傳輸路徑激活，維持Cajal細胞的外型和生理特性。SCL基因異常表達會導致急性T淋巴細胞白血病，且SCL與造血和血管內皮發育有關。SCL屬于多因素復合體的轉化因子，能夠增強ckit誘導因子的活性，但不會影響單核細胞開啟活性的變化［14］。鑒于SCL在Cajal樣間質細胞發育中的關鍵作用，如果通過基因技術組建人SCL基因重組慢病毒載體，將SCL基因轉染Cajal樣間質細胞，增加 SCL的表達，逆轉Cajal樣間質細胞表型和功能的恢復［15］，可為進一步探究DCP的基因治療提供理論依據。

慢病毒作為基因治療的一個常規介質，可以有效且針對性地對分裂或非分裂細胞實現感染，將外源基因有效導入寄主細胞的細胞核上，具有周期長、特性穩固、表達顯著等特點，能夠用來開展體內外實驗。本研究采用的慢病毒包裝系統是三質粒包裝，其中包含1個表達載體，含有目的基因、報告基因GFP、目的基因的啟動子以及其他病毒包裝所需的必要元件;另外包含2個輔助質粒的包裝質粒，表達產生包裝病毒所需的結構蛋白。表達載體和包裝質粒形成反式互補，且包裝質粒又分別由2個質粒構成，安全性得到保障。GFP是一種在藍色光激發下會發出穩定綠色熒光的生物熒光蛋白，無細胞毒性，現已作為標記分子或報告基因被廣泛應用于細胞學和活體組織的檢測。本實驗選用GFP作為慢病毒的標記基因，GFP熒光具有穩定且清晰可見的優點，在熒光顯微鏡下可以對活細胞進行定時、定位的觀察，實驗中可隨時觀察三質粒轉染293T細胞生成病毒的情況，準確、直觀觀察結果。在實驗過程中，我們收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，對其進行反復濃縮、純化，得到高滴度慢病毒原液，轉染293T細胞后測定目的基因表達，并采用熒光法標定病毒滴度。結果表明慢病毒滴度為5×108TU/mL，可滿足大多數轉染相關實驗需求［14，15］。

本研究運用基因工程技術和分子生物學技術，成功制備了人體SCL基因重組慢病毒載體GV287-SCL，慢病毒滴度為5×108TU/mL;上述結果為繼續進行該基因體內轉染及開展DCP的基因治療奠定了基礎。

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