HPLC-DAD法測定冠脈寧片中葛根素和丹酚酸B的量及其指紋圖譜研究

丁 寧 何 軼 何玉梅 王 棟 王瑞忠 魯 靜 戴 忠 馬雙成

(1.內蒙古食品藥品檢驗所中藥室，呼和浩特010011;2.中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所中成藥室，北京100050;3.武警總醫院中醫科，北京100039)

冠脈寧制劑由丹參、血竭、葛根、冰片等十四味中藥組成，具有活血化瘀、行氣止痛等功效，常用于以胸部刺痛、固定不移等為主癥的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)、心絞痛、冠狀動脈供血不足等癥治療［1-4］。冠脈寧制劑現行質量標準較多，其成分的測定項目也差異較大，主要有葛根素、丹酚酸B和丹參素鈉等成分的測定。葛根素為葛根的主要活性成分之一，控制葛根素可有效控制冠脈寧制劑中的葛根藥材質量［5-7］。丹酚酸B和丹參素鈉均為丹參中的活性成分［8-9］，二者均具有清除氧自由基、促細胞增生和修復周圍組織等作用［10-11］。但研究［10-11］認為丹酚酸B的清除氧自由基和誘導胎鼠腦神經干細胞遷移的作用較丹參素鈉強。在丹參藥材中丹酚酸B的量也較高［12］，因此丹酚酸B更適合用于作為丹參質量控制的指標性成分［13］。目前中國藥典中也用丹酚酸B控制丹參藥材質量。為了更好地控制冠脈寧片的質量，筆者已經分別建立了該制劑中化工染料和松香酸的檢查方法以及血竭素、11-羰基-β-乙酰乳香酸和龍腦的量的測定方法［14-16］，本文進一步采用HPLC-DAD法對冠脈寧制劑中的葛根素和丹酚酸B同時進行了測定，并采用該色譜條件對冠脈寧片的指紋圖譜分析方法進行了探討，一測多評，提高檢驗效率并節約檢驗成本。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，2996光電二極管檢測器，Agilent 1200-6410B Triple Quad液-質聯用系統。

1.2 試藥

葛根素 (110752-200912)、丹酚酸 B(111562-201212)、丹參素鈉(110855-200809)、苦杏仁苷(110820-200403)、2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(110844-200908)、血竭素高氯酸鹽(110811-200704)和大黃素甲醚(110758-201114)等對照品由中國食品藥品檢定研究院(中國藥品生物制品檢定所)提供;甲醇(HPLC級，Fisher公司，美國)，甲酸和甲醇均為分析純(北京化工廠)，水為超純水。

1.3 樣品

冠脈寧片56批，均為市售，標示為吉林華康藥業股份有限公司、長春萬德制藥等13家企業生產。

1.4 葛根素和丹酚酸B的量的測定

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇(A)和0.5%甲酸溶液(B)梯度洗脫，0 min A為10%，30 min梯度到90%。流速1.0 mL/min，檢測波長葛根素為250 nm，丹酚酸B為286 nm，進樣量10 μL。

1.4.2 對照品溶液制備

精密稱取葛根素和丹酚酸B對照品適量，加70%甲醇制成每1mL分別含葛根素0.086 88 mg和丹酚酸B 0.111 6 mg的對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液制備

取本品20片(粒)，研細，取0.2 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，精密加入20 mL 70%甲醇，稱定質量，超聲處理20 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失質量，濾過，取續濾液。

1.4.4 陰性樣品溶液制備

按處方比例分別制備不含葛根和丹參的冠脈寧制劑，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

1.5 指紋圖譜研究

1.5.1 色譜條件

同1.4.1，檢測波長為286 nm，進樣量10 μL。

1.5.2 對照品溶液制備

取葛根素、丹酚酸 B、丹參素鈉、苦杏仁苷、2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D 葡萄糖苷、血竭素高氯酸鹽、大黃素甲醚等對照品適量，加70%甲醇制成每1 mL分別含0.1 mg的對照品溶液。

1.5.3 供試品溶液制備

同1.4.3。

2 結果

2.1 葛根素和丹酚酸B的量的測定

2.1.1 系統適用性及專屬性實驗

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液10 μL，在上述色譜條件下分析，色譜圖見圖1-3。葛根素和丹酚酸B的保留時間分別為13.4 min和19.4 min，計算理論板數分別為73 992和115 457，并且與其他雜質峰分離度大于1.5。葛根與丹參陰性樣品溶液色譜圖中，在與葛根素及丹酚酸B對照品相應位置上均有一個較小的色譜峰，但其峰面積小于正常樣品的2%，對樣品測定影響較小。

2.1.2 定量限

將對照品溶液稀釋，進行色譜分析，以信噪比法測定葛根素和丹酚酸B定量限分別為0.20 μg/mL和0.20 μg/mL。

2.1.3 線性關系考察

精密吸取葛根素和丹酚酸B對照品溶液適量，加70%甲醇稀釋成每1 mL各含葛根素0.002 523～0.504 6 mg，含丹酚酸B 0.002 657～0.425 2 mg的混合對照品溶液。分別吸取10 μL，在上述色譜條件下分析，記錄峰面積。以色譜峰面積(y)對對照品濃度(x)進行回歸，計算回歸方程。葛根素回歸方程為y=2.269 2×107x+28 988，r=0.999 9;丹酚酸B 回歸方程為 y=6.441 3×106x-110，r=0.999 9。說明葛根素在0.005 046～0.504 6 mg/mL范圍內，丹酚酸 B在0.002 657～0.425 2 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 重復性試驗

取同一批樣品(通化永倉藥業有限公司，批號20130101)6份，按照1.4.3供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依1.4.1項下色譜條件測定。結果葛根素平均質量分數為8.28 mg/g，RSD為1.4%，丹酚酸B平均質量分數為10.5 mg/g，RSD為1.5%，表明該實驗有良好的重現性。

2.1.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知濃度的樣品(通化永倉藥業有限公司，批號20130101)約10 g共6份，分別加入一定量的葛根素和丹酚酸B混合對照品溶液，按照供試品溶液制備方法制備，計算回收率。葛根素平均加樣回收率為99.53%，RSD值為1.5%，丹酚酸B的平均加樣回收率為102.2%，RSD值為1.4%，結果見表1，2。

圖1 冠脈寧制劑葛根素和丹酚酸B混合對照品溶液Fig.1 HPLC chromatograms of the mixture reference solution of puerarin and salvianolic acid B

圖2 供試品溶液Fig.2 Sample solution

圖3 葛根陰性樣品溶液和丹參陰性樣品溶液Fig.3 Blank sample of Puerariae Lobatae Radix and blank sample of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma

表1 葛根素加樣回收率實驗Tab.1 Recovery results of puerarin

表2 丹酚酸B加樣回收率實驗Tab.2 Recovery results of salvianolic acid B

2.1.6 穩定性試驗

吸取同一供試品(通化永倉藥業有限公司，批號:20130101)，分別于 0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 測定，測得葛根素和丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.4%和1.2%，表明供試品溶液24 h內穩定。

2.1.7 樣品測定

對13個廠家56批次的樣品進行測定，不同樣品中葛根素的量為0.37～8.10 mg/片，丹酚酸B的量為0.08 ～4.10 mg/片，差異較大。

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1 重復性試驗

取樣品(通化永倉藥業有限公司，批號:20130101)按1.5.3項下供試品溶液方法制備供試品溶液，平行制備6份。分別依據1.5.1項下色譜條件測定。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2.0版)計算所得色譜圖之間相似度均大于0.94。

2.2.2 穩定性

取同一供試品溶液(通化永倉藥業有限公司，批號:20130101)，按照1.5.1項下色譜條件分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2.0版)計算所得色譜圖之間相似度均大于0.92。結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.3 指紋圖譜中色譜峰的指認

為進一步對指紋圖譜中的色譜峰進行指認，本試驗采用液相色譜-質譜聯用法對樣品進行了測定。

色譜條件同1.5.1項下。質譜檢測參數:ESI+掃描，毛細管電壓:4 kV，干燥氣:氮氣，干燥氣溫度:300℃，干燥氣流速10 L·min-1，掃描范圍:110～1 000 m/z。葛根素和丹酚酸B由于濃度較高，干擾較小，使用一級質譜進行定性，其余化合物濃度偏小，采用二級質譜進行定性。可在樣品色譜圖中歸屬丹參素鈉、苦杏仁苷、葛根素、2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、丹酚酸B、血竭素高氯酸鹽、大黃素甲醚等化合物，分別來源于丹參、桃仁、葛根、何首烏、血竭等藥材(圖4)。各化合物保留時間及質譜裂解電壓和碰撞能見表3。

圖4 在冠脈寧片樣品色譜圖中指認的化合物Fig.4 The assigned compounds in the chromatography of Guanmaining tablet

表3 各化合物保留時間及質譜裂解電壓和碰撞能Tab.3 The retention time，fragment or voltage and collision energy of chemical compounds

2.2.4 樣品測定

采用國家藥典委員會頒布的指紋圖譜2.0版軟件進行分析。將所得到的56批樣品的色譜圖進行全譜匹配，其相似度計算結果為0.25～0.98。多數批次樣品的指紋圖譜相似度均大于0.8，有22個批次的樣品其相似度低于0.8，占樣品總數的34.4%。

3 討論

在建立方法時，考察了超聲提取15、20和30 min對測定結果的影響。超聲20 min后，葛根素和丹酚酸B的量沒有變化。故最終確定采用超聲提取20 min的提取條件。

本實驗對56批次冠脈寧片進行了測定。不同樣品中丹酚酸B的量為0.08～4.10 mg/片，差異較大。可能是各廠家提取工藝不同，丹酚酸B穩定性差，在水煮過程中易損失。

從樣品中葛根素的測定結果來看，葛根素量偏低的樣品主要集中于一個生產廠家，該廠產品執行的標準中沒有量的測定項。此外，將本文所建立方法的測定結果與使用原藥品標準檢驗的結果比較，所建立方法的量的測定結果除一個批次外均高于原標準方法測定結果。分析原因可能與提取條件不同有關。鑒于冠脈寧制劑藥品標準眾多，每個標準中的提取條件、色譜條件以及制定的限度也不盡相同。因此有必要考慮統一冠脈寧片的質量標準，以進一步控制冠脈寧片的質量。

指紋圖譜相似度測定結果與生產廠家有一定的相關性(Pearson相關性分析，相關系數0.474，P＜0.01)，可能在提取過程中不同廠家還存在工藝的差別。因此有必要對冠脈寧制劑的生產工藝進行研究，規范生產工藝，保證冠脈寧制劑的有效性和安全性。

冠脈寧片中葛根素和(或)丹酚酸B的量的測定方法已有文獻［17-20］報道。本文在進行量的測定的同時，利用所得到的圖譜，對該制劑的指紋圖譜進行了探討，一測多評，有利于節約檢測成本，提高效率。此外文獻中使用的色譜條件為乙腈-甲醇-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫，本文改用可揮發的甲酸作為流動相，便于在指紋圖譜研究時借助液相質譜聯用確認色譜峰，提高指紋圖譜的針對性。

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