HTERC基因在宮頸上皮內瘤樣病變治療后監測的相關性研究

周麗紅 賀昕紅 龍 燕 藺 莉

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院婦產科，北京100050)

宮頸癌是嚴重危害婦女健康的常見惡性腫瘤，發病率僅次于乳腺癌。經過幾十年廣泛開展婦科普查，宮頸癌的發病率及病死率降低了近68%，但仍居我國婦女惡性生殖道腫瘤第一位，且發病正呈現一種年輕化趨勢［1-2］。目前認為高危型人乳頭瘤病毒(high risk-human papillomavirus，HR-HPV)感染是首要病因［3-4］。近年的研究［5-7］表明，宮頸細胞由瘤樣病變向宮頸癌轉變的過程中幾乎都伴有3號染色體長臂擴增，涉及到的最重要的基因是人端粒酶RNA基因(human telomerase RNA component，HTERC)。應用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridizatiom，FISH)技術進行3號染色體長臂擴增發現從正常宮頸、宮頸炎(chronic cervicitis，CC)、宮頸細胞內瘤變到宮頸癌，HPV和端粒酶的協同表達及表達強度依次增加［3］。有研究［7］顯示對宮頸上皮內瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)患者隨訪發現，CINⅠ病變消退者HTERC基因的表達量與正常患者無差異。由于CIN治療后有5% ～10%的殘留和復發率［4］，治療后的長期隨訪非常重要。不同程度宮頸病變治療后應用FISH技術檢測HTERC基因在隨訪中的應用價值如何，相關報道較少。本研究在前期研究基礎上旨在對不同級別宮頸上皮內瘤變的患者行治療后進行1年隨訪，應用FISH技術和原位雜交捕獲法檢測宮頸HTERC基因表達，希望發現術后HTERC陰性者宮頸病變無復發或者殘留病變會消退，而HTERC陽性者宮頸病變有復發或者殘留病變會進行性發展，進一步探討HTERC基因檢測在宮頸CIN治療后的病情檢測中的價值，希望發現宮頸癌的易感人群并進行重點監測、及時治療，降低宮頸癌的發病率。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取首都醫科大學附屬北京友誼醫院婦產科2012年2月至2012年10月陰道鏡下宮頸活檢病理診斷結果為CIN及原位癌的患者作為研究對象，共有83例病例非隨機連續入組。患者治療前后均行宮頸脫落細胞學檢查、高危型人乳頭瘤病毒檢測及HTERC基因檢測。

1.2 方法

1.2.1 HTERC檢測標本收集

使用宮頸脫落細胞學檢查(thin prep cytologic test，TCT)細胞釆集刷插入宮頸外口鱗柱狀上皮交界處，并以子宮頸外口為中心，均勻旋轉5～7周，取出宮頸刷后，刷頭放入TCT細胞保存液內搖勻，使采集細胞溶于保存液內，注明檢查者姓名、年齡、取材日期，采用FISH方法檢測。

1.2.2 FISH技術檢測HTERC基因方法

取5～10 mL采集的細胞樣本，經多次離心，膠原酶B、胃蛋白酶消化，梯度脫水后制片進行FISH操作:將玻片清洗梯度脫水變性，避光環境中配置探針混合液滴于雜交區域，雜交過夜。第二天玻片洗脫，自然干燥玻片，DAPI復染，加蓋玻片，暗處放置20 min后進行顯微鏡下FISH信號觀察。在暗室內，使用日本 Olympus BX51型熒光顯微鏡，DAPI/FIFC/Texas Red三色濾光鏡激發觀察間期細胞熒光雜交信號，并用俄羅斯Video-Test公司提供的FISH分析軟件進行圖像分析。

1.2.3 FISH信號判斷

正常細胞單個間期細胞核中紅色及綠色信號各為2個，如圖1。HTERC基因擴增異常細胞單個間期細胞核中紅色信號大于2個，綠色信號不少于2個，如圖2。在熒光顯微鏡下觀察FISH信號:每例分析200個間期細胞核，對各通道下均顯示清晰可辨的、孤立的、雜交信號明顯的細胞核進行計數，并計算其所占百分比。對重疊、破損、輪廓不清的信號不計數，雜交信號微弱者不計數。細胞內雜交信號互相靠近者計為1個信號。以20個正常宮頸FISH結果作為標準，以3個及以上紅色信號的間期細胞比例＞9.23%者為HTERC基因擴增陽性患者;≤9.23%者為陰性患者。

1.3 統計學方法

用SPSS 18.0軟件進行數據統計分析。計數資料用例數表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。等級資料用例數表示，治療前、后比較采用配對秩和檢驗。檢驗水準均為α=0.05。

圖1 HTERC擴增陰性細胞Fig.1 Cell with negative HTERC

2 結果

2.1 治療前情況

圖2 HTERC擴增陽性細胞Fig.2 Cell with positive HTERC

治療前各級CIN中HR-HPV及HTERC檢測情況詳見表1，隨CIN分級增加，HTERC擴增陽性率明顯增加，差異具有統計學意義(χ2=18.97，P=0.000)，兩兩比較發現，CINⅠ與CINⅡ之間差異無統計學意義，而CINⅠ、CINⅡ分別與CINⅢ之間差異具有統計學意義;隨CIN分級增加，高危型HPV感染陽性率有增加趨勢，但差異不具有統計學意義(χ2=4.347，P=0.061)。HTERC陽性表達患者均合并HR-HPV感染。

表1 各級CIN中HTERC擴增及高危型HPV感染情況Tab.1 All levels of HTERC amplification and high-risk type HPV infection in CIN n(%)

2.2 治療后隨訪情況

全部83例患者中僅2例宮頸錐切術患者、手術病理為宮頸浸潤癌Ia1，于宮頸錐切治療后1～2個月行全子宮切除術，另1例宮頸錐切病理顯示為CINⅢ(原位癌)，患者要求行全子宮切除術，該3例全子宮切除術患者治療后復查病理未見異常。治療后半年隨訪成功76例，失訪7例，該76例患者治療后1年成功隨訪。失訪7例患者治療前CIN分級分別為CINⅠ1例(HR-HPV陽性、HTERC陰性)、CINⅡ 2例(均HR-HPV陽性、HTERC陰性)、CINⅢ 4例(3例均HR-HPV陽性、HTERC陽性，1例HR-HPV陽性，HTERC陰性)，失訪原因為4例患者妊娠狀態，3例患者因異地拒絕來院隨訪。

2.2.1 各級宮頸病變治療后轉歸情況

治療后半年及1年宮頸病變轉歸情況詳見表2。治療后半年宮頸病變與治療前相比，差異具有統計學意義(Z=-7.680，P=0.000)。治療后1年宮頸病變與治療前相比，差異具有統計學意義(Z=-7.689，P=0.000)。

2.2.2 宮頸脫落細胞學轉歸與宮頸病變關系

治療后復查宮頸脫落細胞學情況詳見表3，治療前宮頸脫落細胞檢查結果為無上皮內病或惡性病變(negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM)9 人、非典型鱗狀細胞(atypical squamous cell of undetermined significance，ASC)31人、低度鱗狀細胞病變(lower-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)24 人、高度鱗狀細胞病變(higher-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)12人，治療后半年宮頸脫落細胞學情況與治療前比較，差異具有統計學意義(Z=-7.287，P=0.000)，治療后1年宮頸脫落細胞學情況與治療前比較，差異具有統計學意義(Z=-7.259，P=0.000)。

表2 治療后各級宮頸病變轉歸情況Tab.2 The outcome of all levels of CIN after treatment

表3 治療后宮頸脫落細胞學轉歸與宮頸病變關系Tab.3 The relation of cervical exfoliated cytology outcome with cervical lesions after the treatment

2.2.3 治療后HR-HPV轉歸與宮頸病變關系

治療后復查HR-HPV情況詳見表4，治療前HRHPV陽性患者約72人、陰性約4人，治療后半年復查情況與治療前比較，差異具有統計學意義(Z=-6.557，P=0.000)，治療后1半年復查情況與治療前比較，認差異具有統計學意義(Z=-7.416，P=0.000)。

表4 治療后HR-HPV轉歸與宮頸病變情況Tab.4 Relation of HR-HPV with cervical lesions after the treatment

2.2.4 治療后HTERC轉歸與宮頸病變關系

76例隨訪成功患者，治療后半年及1年復查HTERC均為陰性(治療后半年CC 64例、CINⅠ 10例、CINⅡ1例、CINⅢ 1例，治療后1年CC 73例、CINⅠ3例)，治療后半年及1年與治療前比較，差異具有統計學意義(Z=-5.745，P=0.000)。

2.2.5 HTERC陽性和HTERC陰性的宮頸病變患者治療后轉歸情況

1)HTERC陽性的宮頸病變患者治療后轉歸情況:治療前共36例HTERC陽性的宮頸病變患者、其中CINⅠ 4例，CINⅡ 7例，CINⅢ 25例(脫訪3例)，治療后宮頸病變轉歸情況詳見表5。治療后半年宮頸病變轉歸情況與治療前相比，差異具有統計學意義(Z=-5.045，P=0.000)。治療后1年宮頸病變與治療前相比，差異具有統計學意義(Z=-5.184，P=0.000)。

表5 HTERC(+)治療后半年及1年宮頸病變轉歸情況Tab.5 Relation of HTERC(+)with cervical lesions after the treatment

2)HTERC陰性的宮頸病變患者治療后轉歸情況:治療前HTERC陰性患者共47例，其中CINⅠ38例(失訪1例)、CINⅡ3例(失訪2例)、CINⅢ 6例(失訪1例)，治療后復查情況見表6。治療后半年宮頸病變轉歸情況與治療前相比，差異具有統計學意義(Z=-6.308，P=0.000)。治療后1年宮頸病變與治療前相比，差異具有統計學意義(Z=-6.209，P=0.000)。

表6 HTERC(-)治療后半年及1年宮頸病變轉歸情況Tab.6 The relation of HTERC(-)with cervical lesions after the treatment

3 討論

目前宮頸癌及宮頸上皮內瘤樣病變的常規篩查手段主要有宮頸脫落細胞學及HPV檢測，宮頸脫落細胞學檢測易出現假陰性［6，8］。高危型HPV感染是宮頸癌發病的首要因素，絕大部分女性一生中都存在HPV的感染，但僅極少數發展成宮頸癌。潘虹等［4］對700例患者進行HPV-DNA檢測及液基細胞學檢查，結果顯示，ASCUS、LSIL、HSIL、宮頸鱗狀細胞癌的HPV陽性率分別為67%、93.3%、100%、100%，而正常宮頸HPV陽性率為43.6%。HPV檢測對于宮頸癌篩查特異性差，且大部分HPV感染往往能自行消退，故單純HPV檢測有增加宮頸病變過度治療可能［9］。宮頸脫落細胞學或HPV檢測不能從基因角度篩查宮頸病變，更無法從基因角度預測篩查出的CIN哪些將會進展為宮頸癌。當今宮頸癌篩查及預后監測越來越引起人們的關注，如何尋找一種靈敏度、特異度好又衛生經濟的篩查預后評估方案成了國內外學者奮斗的目標。

近年研究［7，10-13］表明宮頸細胞由非典型病變向癌轉變的過程中幾乎都伴有3號染色體長臂擴增，其中涉及到的最重要的基因可能是HTERC基因。HTERC定位在3q23.3，約450 bp，其序列中有一長度為11個核苷酸(5'-CUAACCCUAAC-3')片段，與人類端粒的重復序列(TTAGGG)互補，視為合成端粒重復序列的模板。Hopman等［14］發現HTERC編碼的端粒酶核糖核酸為端粒酶的重要組成成分，端粒酶活性主要在腫瘤組織中表達，正常組織它通過直接合成六聚體三核苷酸末端N進入染色體3'端，并以內部RNA作為模板形成末端結構特異的染色體DNA，即端粒，從而介導細胞的老化和腫瘤的形成。FISH主要是利用DNA序列的互補性，通過熒光標記的DNA探針與預處理的待測樣本的DNA進行原位雜交，在熒光顯微鏡下，對熒光信號進行辨別和計數，即可對細胞中的染色體或基因異常進行檢測和診斷，而檢測的標本可以是中期分裂象也可以是間期細胞。由于技術本身操作簡單、重復性好、具有較高的靈敏度及特異度等幾大優點，因此很適合臨床醫學檢測，但存在費用較高的問題。

通過 FISH 檢測，多項研究［12，14-16］顯示 HTERC 基因在各級宮頸病變中均有一定程度的表達，HTERC基因的陽性率隨宮頸病變的分級而有上升趨勢，且HTERC基因在高度病變中的陽性率明顯高于低度病變，HTERC有望成為宮頸癌前病變早期診斷的生物學分子，本研究的治療前實驗結果與上述國內外的研究一致。

Heselmeyer-Haddad等［17］發現 HTERC 基因表達水平與宮頸癌的分級、分期及淋巴轉移呈正相關，并回顧性的對1至3年前婦女的液基細胞學標本進行HTERC基因檢測發現，HTERC擴增陽性的患者，無論正常宮頸組織及還是CINⅠ及CINⅡ，均進展為CINⅢ或宮頸癌，HTERC擴增陰性的CINⅢ則消退為正常宮頸。說明HTERC與宮頸病變進展有關，并可能在其中發揮重要作用。Alaneda等［18］研究中對30例CINⅠ患者進行2年長期隨訪，發現CINⅠ病變消退者HTERC基因的表達量與正常患者無差異，且顯著低于持續存在或進展的CINⅠ。但該研究僅對CINⅠ患者進行隨訪觀察，未行宮頸治療。由于CIN治療后有一定的殘留和復發率，治療后的長期隨訪非常重要。宮頸病變不同程度(CINⅠ～Ⅲ和原位癌)治療后應用FISH技術檢測HTERC基因在隨訪中的應用價值如何，相關報道較少，有學者［19-21］對CINⅠ/CINⅡ行宮頸環形電切術(loop electrosurgical excision procedure，LEEP)治療后隨訪6個月，結果顯示治療后FISH檢測HTERC基因陽性表達率較治療前的明顯降低，但HTERC基因表達強陽性患者治療后病變殘留率較HTERC基因表達陰性、弱陽性及中等陽性患者升高。本研究治療后半年宮頸病變異常程度、宮頸脫落細胞學異常情況、高危型HPV陽性率及HTERC基因檢測陽性率均較治療前明顯減少、僅存在2例宮頸病變，可見手術治療能有效的降低宮頸病變的程度及使宮頸病變消退，降低宮頸細胞學異常程度、高危型HPV陽性率及HTERC基因的陽性率。本研究資料顯示HTERC基因表達陽性患者治療后病變殘留率與HTERC基因表達陰性患者無差異，與上述文獻相異可能與本院治療效果及樣本量相關;治療后半年HTERC基因均為陰性，76例患者中僅存在12例宮頸病變(10例CINⅠ、1例CINⅡ、1例CINⅢ)，治療后1年復查有9例CINⅠ病變均消失，1例持續為CINⅠ，1例CINⅡ減輕為CINⅠ，1例CINⅢ在行全子宮切除術后復查病理正常，此外1例慢性炎(合并高危型HPV感染)在治療后1年病理進展為CINⅠ(持續合并高危型HPV感染)。表明治療后半年HTERC陰性的CINⅠ患者在治療后1年內病變消退可能性大，HTERC基因檢測能較好預測治療后宮頸病變進一步發展情況，但因樣本及時間有限，需進一步觀察。臨床中，因HTERC檢測費用較高，暫不適宜用于篩查宮頸癌及宮頸病變，在患者有HR-HPV持續感染、特別是宮頸出現CIN改變時，可行HTERC基因檢測輔助預測病變的發展情況。

Chen等［22］用FISH技術檢測671人的宮頸細胞中HTERC基因的擴增情況，發現HTERC陽性的靈敏度及特異度分別為90%和89.6%，HPV陽性的靈敏度及特異度分別為100%和44%。可見HTERC陽性擴增率具有較高的特異度，HPV具有較高的靈敏度。本研究發現治療復查，宮頸脫落細胞學檢查對于宮頸病變預測的陽性預測值相對較強，治療后半年和1年分別為50%(3/6)和100%(2/2)，HR-HPV檢查對于宮頸病變預測的靈敏度和陰性預測值相對較高，治療后半年和1年靈敏度分別為83.3%(10/12)和66.7%(2/3)，治療后半年和1年陰性預測值分別為95.7%(45/47)和98.3%(58/59)，HTERC檢測對于宮頸病變預測特異度最高，分別為100%(64/64)和100%(73/73)。HTERC基因檢測的特異度最好，高危型HPV的靈敏度及陰性預測值較好，宮頸脫落細胞學檢測的陽性預測值較高。本研究治療后HTERC基因檢測均為陰性，可能與研究對象均為手術治療后的患者及樣本數量小相關，需擴大樣本量及延長隨訪時間。

綜上所述，隨宮頸病變程度增加，HTERC基因檢測陽性率增加且差異具有統計學意義;手術治療能有效降低宮頸病變程度、高危型HPV陽性率及HTERC基因的陽性表達率［23］;在患者有HR-HPV持續感染、特別是宮頸出現CIN改變時，可行HTERC基因檢測輔助預測病變的發展情況;本研究發現，患者治療后在上述幾項監測方法中，HTERC基因檢測的特異度最好，高危型HPV的靈敏度及陰性預測值較好，宮頸脫落細胞學檢測的陽性預測值較高。

［1］ Cox J T，Castle P E，Behrens C M，et al.Comparison of cervical cancer screening strategies incorporating different combinations of cytology，HPV testing，and genotyping for HPV 16/18:results from the ATHENA HPV study［J］.Am J Obstet Gynecol，2013，208(3):184 e181-184 e111.

［2］ Ronco G，Dillner J，Elfstr?m K.M，et al.Efficacy of HPV-based screening for prevention of invasive cervical cancer:follow-up of four European randomised controlled trials［J］.Lancet，2014，383(9916):524-532.

［3］ 李秋霞，張玉英，石青嶺，等.巴氏涂片與液基細胞學(TCT)宮頸檢查結果分析［J］.中國現代藥物應用，2010，4(9):95-96.

［4］ 潘虹，陳麗艷.高危型人乳頭瘤病毒HC2檢測在宮頸上皮內瘤變篩查中的意義［J］.腫瘤預防與治療，2011，24(6):332-334.

［5］ 楊維娜，尹利榮，段青，等.宮頸上皮內瘤變治療前后hTERC基因表達結果分析［J］.天津醫藥，2010，38(8):654-665.

［6］ Zhen S，Hu C M，Bian L H.Glutathione S-transferase polymorphism interactions with smoking status and HPV infection in cervical cancer risk:an evidence-based meta-analysis［J］.PloS one，2013，8(12):e83497.

［7］ Pileggi C，Flotta D，Bianco A，et al.Is HPV DNA testing specificity comparable to that of cytological testing in primary cervical cancer screening?Results of a meta-analysis of randomized controlled trials［J］.Int J Cancer，2014，135(1):166-177.

［8］ 劉冠軍，吳冬梅，程慧欣.宮頸傳統脫落細胞學結果與患者年齡及臨床診斷相關性分析［J］.中國煤炭工業醫學雜志，2012，15(12):1835-1838.

［9］ 黃寶英，周倫順，富顯果，等.HPV 1/E7 mRNA檢測對宮頸癌篩查意義的初步評價［J］.中華腫瘤防治雜志，2013，20(14):1061-1064.

［10］Li T，Tang L，Bian D，et al.Detection of hTERC and c-MYC genes in cervical epithelial exfoliated cells for cervical cancer screening［J］.Int J Mol Med，2014，33(5):1289-1297.

［11］Bin H，Ruifang W，Ruizhen L，et al.Detention of HPV L1 capsid protein and hTERC gene in screening of cervical cancer［J］.Iran J Basic Med Sci，2013，16(6):797-802.

［12］ He C，Xu C，Xu M，et al.Genomic amplification of hTERC in paraffin-embedded tissues of cervical intraepithelial neoplasia and invasive cancer［J］.Int J Gynecol Pathol，2012，31(3):280-285.

［13］Chen M，Xing L N.siRNA-mediated inhibition of hTERC enhances radiosensitivity of cervical cancer［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2012，13(12):5975-5979.

［14］Hopman A H，Theelen W，Hommelberg P P，et al.Genomic integration of oncogenic HPV and gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 are strongly associated events in the progression of uterine cervical dysplasia to invasive cancer［J］.J Pathol，2006，210(4):412-419.

［15］ Andersson S，Sowjanya P，Wangsa D，et al.Detection of genomic amplification of the human telomerase gene TERC，a potential marker for triage of women with HPV-positive，abnormal Pap smears［J］.Am J Pathol，2009，175(5):1831-1847.

［16］Tu Z，Zhang A，Wu R，et al.Genomic amplification of the human telomerase RNA gene for differential diagnosis of cervical disorders［J］.Cancer Genet Cytogenet，2009，191(1):10-16.

［17］Heselmeyer-Haddad K，Sommerfeld K，White N M，et al.Genomic amplification ofthe human telomerase gene(TERC)in pap smears predicts the development of cervical cancer［J］.Am J Pathol，2005，166(4):1229-1238.

［18］ Alameda F，Espinet B，Corzo C，et al.3q26(hTERC)gain studied by fluorescence in situ hybridization as a persistence-progression indicator in low-grade squamous intraepithelial lesion cases［J］.Hum Pathol，2009，40(10):1474-1478.

［19］Ciavattini A，Stortoni P，Mancioli F，et al.The impact of loop electrosurgical excision procedure(LEEP)for CIN 2，3 on spontaneous preterm delivery in twin pregnancies by assisted reproductive technique:preliminary data［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2014，27(11):1169-1171.

［20］ Duesing N，Schwarz J，Choschzick M，et al.Assessment of cervical intraepithelial neoplasia(CIN)with colposcopic biopsy and efficacy of loop electrosurgical excision procedure(LEEP)［J］.Arch Gynecol Obstet，2012，286(6):1549-1554.

［21］ Singh A，Arthur B，Agarwal V.LEEP verses cryotherapy in CIN［J］.J Obstet Gynaecol India，2011，61(4):431-435.

［22］ Chen S，Yang Z，Zhang Y，et al.Genomic amplification patterns of human telomerase RNA gene and C-MYC in liquid-based cytological specimens used for the detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia［J］.Diagn Pathol，2012，7:40.

［23］常小壘，郭科軍，張頤.HPV亞型與子宮頸癌前病變及癌變的關系探討［J］.中國醫科大學學報，2014，43(8):720-723，727.