MiR-886-5p對宮頸鱗狀上皮細(xì)胞克隆形成和宮頸癌細(xì)胞化學(xué)藥物治療的影響

李晶華 王 明 張 瑞 馮力民*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京100050;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京100069)

宮頸癌是女性第三大常見的惡性腫瘤。高危型人乳頭瘤病毒(human papilomavirus，HPV)感染是宮頸組織惡性變的必要而非充分條件，其他因素參與了HPV感染后宮頸組織的進(jìn)一步癌變。弄清宮頸癌的發(fā)生、進(jìn)展中所涉及的分子機(jī)制，對于尋找宮頸癌更有效的診斷和治療具有非常重要的意義［1-3］。

MicroRNA是存在于真核細(xì)胞中的一類長約22個核苷酸的非編碼序列，它在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在多種癌癥中存在microRNA的突變或異常表達(dá)，其在腫瘤發(fā)生中的角色正日益受到關(guān)注。MicroRNA實際上可作為癌基因或者腫瘤抑制基因而發(fā)揮作用。

本課題組前期研究［4］表明MiR-886-5p在宮頸癌組織中高表達(dá)。并發(fā)現(xiàn)Bax等P53通路中多個基因帶有MiR-886-5p的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性高表達(dá)的MiR-886-5p在翻譯水平上阻止了Bax的表達(dá)。在MiR-886-5p靶向Bax影響SiHa細(xì)胞凋亡的檢測系統(tǒng)中，外源性敲減MiR-886-5p可能直接降低抑制Bax的翻譯能力而發(fā)凋亡作用。過表達(dá)MiR-886-5p，可以促進(jìn)了細(xì)胞的增生，而且這種增生呈時間依賴性。

化學(xué)藥物治療(以下簡稱化療)是宮頸癌的輔助治療之一。近年來，對于局部進(jìn)展IB2或II期以上宮頸癌患者采用以鉑類為基礎(chǔ)的同步放化療(concurrent radiochemotherapy，CRT)，療效好于單純的放療患者［5］。但宮頸癌組織為非化療敏感性腫瘤，常存在化療耐藥現(xiàn)象。多藥耐藥是腫瘤化學(xué)治療過程中的常見現(xiàn)象。筆者推測存在某種分子影響宮頸癌的化療耐藥和預(yù)后。確定這種分子的結(jié)構(gòu)和功能，對宮頸癌的發(fā)病和治療有非常重要的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料

H8細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，中國)。宮頸癌 SiHa細(xì)胞系購自于美國 ATCC。DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和鏈青霉素(PS)(Hyclone公司)，P53抗體和β-actin(Santa Cruz公司，美國)抗體，二抗和蛋白酶抑制劑Cocktail(Sigma公司，美國)。紫杉醇脂質(zhì)體(力樸素)(南京思科藥業(yè)公司)。轉(zhuǎn)染試劑:MiR-886-5p過表達(dá)載體及其陰性對照載體(上海吉瑪生物制品公司，中國);SiPORTTM NeoFXTM Transfection Agent(Ambion公司，美國);LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

H8細(xì)胞和SiHa細(xì)胞用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2.2 轉(zhuǎn)染

分別轉(zhuǎn)染H8細(xì)胞MiR-886-5pmimics和帶有GFP標(biāo)簽的過表達(dá)載體(50 nmol/L)及陰性對照(50 nmol/L)后(用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，載體與轉(zhuǎn)染試劑1∶1配制)，取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。MiR-886-5p mimics MiR-886-5p mimics序列:正義鏈5'-CAAGAGCAAGCCCAAGGAUtt-3';反義鏈:5'-AUCCUUGGGCUUGCUCUUGtt-3'。Negative control MiR-886-5p mimics序列:正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3';反義鏈5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。轉(zhuǎn)染前，用5 mL不含PS的培養(yǎng)基將H8細(xì)胞接種至直徑為100 mm的培養(yǎng)皿中。于兩管500 μL DMEM培養(yǎng)基中分別加入適量MiR-886-5p mimics，終濃度分別為 25 nmol/L，40 nmol/L，50nmol/L和等濃度的siPORTTM，置于室溫中孵育10 min。將這兩管培養(yǎng)基混合，再次置于室溫中孵育10 min。將混合液加入到細(xì)胞的培養(yǎng)基中來回輕輕混勻。將細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將Negative control microRNA mimics(終濃度為50 nmol/L)作為對照，按相同的操作轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。6～8 h后換液，48 h后收集細(xì)胞檢測P53、P14 mRNA的表達(dá)情況。

過表達(dá)載體序列正義鏈:5'-TGCTGCGGGTCGGAGTTAGCTCAAGCGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCGCTTGATAACTCCGACCCG-3';反義鏈:5'-CCTGCGGGTCGGAGTTATCAAGCGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCGCTTGAGCTAACTCCGACCCGC-3'。Negative control MiR-886-5p過表達(dá)載體序列正義鏈:5'-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCAAGTACATTT-3';反義鏈:5'-CCTGAAATCTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC-3'。將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度(根據(jù)增生能力)接種于培養(yǎng)皿中。一般分每皿50、100、200個細(xì)胞的梯度密度分別接種含10 mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5%CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2～3周。經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或1∶3醋酸/甲醇5 mL，固定15 min。然后去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3 Western blotting檢測

將處理好的細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于冰上。用冷的PBS洗2次，倒掉PBS。用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來，懸于1 mL PBS中，轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管內(nèi)。在4℃條件下，以4 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀。向EP管內(nèi)加入100～625 μL的細(xì)胞裂解液。提取總RNA部分的裂解混合液中加入等體積的2×變性溶液防止RNA降解。總蛋白部分的裂解混合液冰上放置5～10 min。以17 000 r/min 4℃離心15 min，取上清即為細(xì)胞的總蛋白。向溶液中加入4倍上樣緩沖液，100℃加熱5 min。SDSPAGE電泳分離蛋白質(zhì)條帶，電轉(zhuǎn)移到NC膜上。用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉在室溫封閉NC膜1 h，一抗(1∶500，0.5%脫脂奶粉稀釋)4℃孵育過夜，洗膜后，二抗〔1∶5 000，0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉稀釋〕室溫孵育1 h，洗膜后，用超敏發(fā)光試劑盒檢測熒光。

1.2.4 Real time qRT-PCR

檢測SiHa細(xì)胞中加入紫杉醇和VP16后MiR-886-5p的表達(dá)。在SiHa細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞貼壁長至合適密度后，根據(jù)不同實驗條件分別處理細(xì)胞，繼續(xù)在37℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)細(xì)胞。提取總RNA，取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以cDNA作為PCR反應(yīng)模板，設(shè)計引物及內(nèi)參引物。MiR-886-5p:Stem-loop RT引物序列:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCGCTT-3';上游引物序列:5'-CGGGTCGGAGTTAGCTCA-3';下游引物序列:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';內(nèi)參U6snRNA:Stem-loop引物為5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3';上游引物序列:5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3';下游引物序列:5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min;循環(huán)為94℃變性30 s，65℃退火45 s，72℃延伸1 min，共進(jìn)行35個循環(huán)，72℃終末延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料統(tǒng)計描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，配對資料的比較應(yīng)用配對設(shè)計的Student's t-test，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Illumina基因芯片篩選結(jié)果

用于芯片檢測的12個樣本(6對)芯片雜交后，信號值均在有意義的范圍，數(shù)據(jù)可用于后期分析。宮頸癌或癌周組織中檢測出1 145個microRNAs。應(yīng)用Illumina Bead Studio軟件分析發(fā)現(xiàn)在宮頸癌及癌周組織中差異表達(dá)的microRNAs。在表1中，列出了7個差異表達(dá)的microRNAs將組織標(biāo)本分成2組，宮頸癌組和癌周對照組。其中，MiR-886-5p、miR-610、miR-10a* 和miR-30a*在宮頸癌組織中表達(dá)明顯高于癌周組織;而宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)的包括miR-302d、miR-346和miR-518b，MiR-886-5p在宮頸癌組織中高表達(dá)。

表1 宮頸癌組織中表達(dá)明顯高于/低于癌周組織的miRNAs的差異分值情況Tab.1 The diff score of between cervical cancer and Adjacent cervical tissues in microarray

2.2 MiR-886-5p靶基因的預(yù)測及在細(xì)胞通路中的富集

結(jié)合不同的計算特點(diǎn)，選擇了miRBase網(wǎng)站的Micro Cosm Targets和Target Scan方法對MiR-886-5p的靶基因進(jìn)行了分析，結(jié)果找到1 191個MiR-886-5p的靶基因。將這1 000多個靶基因?qū)隓AVID網(wǎng)站的KEGG細(xì)胞通路中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 P53通路里的Bax、P14ARF、GADD45B和14-3-3δ均為MiR-886-5p預(yù)測的靶基因。結(jié)合上述富集結(jié)果及文獻(xiàn)閱讀分析候選的基因是否與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及凋亡相關(guān)，最終選擇了P53通路作為后續(xù)研究的MiR-886-5p候選靶基因(圖1)。

圖1 MiR-886-5p和P53通路中靶基因Fig.1 Target gene of enrichment to the P53 pathway(Green for the MiR-886-5p target genes)

2.3 平板克隆形成實驗

H8細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了MiR-886-5p過表達(dá)載體及其陰性對照載體，過表達(dá)MiR-886-5p后，H8細(xì)胞克隆率較對照組明顯增加(80%)(P＜0.05)，而且轉(zhuǎn)染了MiR-886-5p過表達(dá)載體的H8克隆細(xì)胞體積明顯大于陰性對照組(P＜0.05)(圖2)。

圖2 過表達(dá)MiR-886-5p促進(jìn)H8細(xì)胞克隆形成Fig.2 Overexpression of MiR-886-5p promotes H8 cell colony formation

2.4 MiR-886-5p對P53通路中P14及P53蛋白的影響

為了解MiR-886-5p對p53通路中其他蛋白的影響，本研究檢測了P14和P53兩種蛋白。H8細(xì)胞轉(zhuǎn)染50 nmol/L濃度的MiR-886-5p mimics后(操作及處理同前)，48 h后收集細(xì)胞中總蛋白，與Negative control相比，H8細(xì)胞中P14和P53蛋白表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，n=3，圖 3)。

2.5 化療藥物宮頸癌細(xì)胞中MiR-886-5p的影響

SiHa細(xì)胞對紫杉醇的敏感濃度約為0.5 μg/mL，所以選擇以0、2.5、5 μg/mL濃度梯度的紫杉醇，以及0/0.5 μg/mL 和 1 μg/mL 濃度的 VP16 處理 SiHa細(xì)胞48 h，RT-PCR檢測加藥前、后MiR-886-5p的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加藥后，MiR-886-5p水平明顯升高(圖4)。

3 討論

MicroRNA(MiRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的存在于真核細(xì)胞中的一類長約21～22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它們調(diào)節(jié)靶mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率。有關(guān)microRNA與腫瘤的發(fā)病及治療的研究發(fā)現(xiàn)，二者具有很大的相關(guān)性。在宮頸癌的發(fā)病中，Wang等［6］研究證明了HPV E6癌蛋白通過降解P53來抑制抑癌基因miR-34a的表達(dá)的直接依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除HPV18 E6后P53和P21cip1穩(wěn)定表達(dá)，miR-34a表達(dá)明顯上調(diào)。而在正常的角質(zhì)化細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)了HPV E6反轉(zhuǎn)錄病毒后，P53失去原有的穩(wěn)定性，miR-34a也明顯下調(diào)。Lee等［7］檢測發(fā)現(xiàn) miR-127升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。對上調(diào)倍數(shù)明顯的miR-199a研究發(fā)現(xiàn)，體外轉(zhuǎn)染了抗miR-199a的寡聚核苷酸抑制了宮頸癌細(xì)胞的生長。所以Lee等［7］認(rèn)為，miR-127可以作為ISCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個標(biāo)志物，而miR-199a可以作為治療的靶點(diǎn)。Yao等［8］用HeLa細(xì)胞系證明了PDCD4是miR-21的靶基因，并且發(fā)現(xiàn)了抑制miR-21在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)可以抑制細(xì)胞增生和減少克隆形成。

圖3 過表達(dá)MiR-886-5p降調(diào)了H8細(xì)胞中P14和P53蛋白的表達(dá)Fig.3 Over-expression of MiR-886-5p affects the P14 and P53 expression in H8 cells

圖4 SiHa細(xì)胞中加入紫杉醇和VP16后，MiR-886-5p表達(dá)增加Fig.4 Paclitaxel and VP16 affects the MiR-886-5p expression in SiHa cells

在宮頸癌發(fā)病的兩條通路中，P53的表達(dá)異常是細(xì)胞凋亡通路障礙的主要原因，P53作為細(xì)胞凋亡的一個重要因子，在整條通路中起了非常重要的作用。P53是對抗腫瘤發(fā)生、調(diào)控細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)中心，它作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著編碼和非編碼RNA的表達(dá)。敲除P53的裸鼠，短時間內(nèi)形成腫瘤。一半以上的人類癌癥中P53發(fā)生突變，剩余的50%的癌癥患者，野生型P53的功能被P53通路中表達(dá)異常的上下游基因所抑制［9］。在各種應(yīng)激下，P53被激活，迅速修復(fù)DNA損傷并且抑制致瘤細(xì)胞的增生，這些過程都是通過直接啟動細(xì)胞凋亡的過程來實現(xiàn)的。各種壓力信號，例如DNA的損傷、癌基因的激活、異常有絲分裂、細(xì)胞間聯(lián)系的失控等，在激活P53的同時，也導(dǎo)致了細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［10］。在宮頸癌細(xì)胞的形成和發(fā)展過程中，microRNA-P53-靶基因或者P53-microRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還未完全清晰，是將要探討的主要內(nèi)容之一。

本研究通過基因芯片技術(shù)篩選宮頸癌及其癌周組織中microRNA的差異表達(dá)情況，結(jié)果顯示MiR-886-5p在宮頸癌組織中高表達(dá)，通過生物信息系技術(shù)發(fā)現(xiàn)其與宮頸癌發(fā)病相關(guān)的P53通路中的多個基因相關(guān)。前期的實驗［4］已驗證，MiR-886-5p影響宮頸癌細(xì)胞增生和凋亡。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗證了MiR-886-5p對細(xì)胞克隆形成的影響，結(jié)果顯示導(dǎo)入帶有GFP標(biāo)簽的MiR-886-5p后，永生化的宮頸上皮鱗狀細(xì)胞的克隆形成增強(qiáng)。同時在H8細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MiR-886-5p的mimics，檢測P53通路的2個重要因子P53和P14表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)P14和P53的蛋白表達(dá)降低了，進(jìn)一步證實了MiR-886-5p通過影響P53通路中的眾多基因如Bax、P53等基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增生。

在宮頸癌的治療中，化學(xué)治療方法得到了越來越廣泛的應(yīng)用，但相同臨床分期、病理診斷、身體狀況評分的患者采用相同的化療方案后，其療效、預(yù)后差別很大。Sardi等［11］報道IIb期宮頸癌患者對 VBP(長春新堿+博萊霉素+順鉑)化療方案的緩解率為73.7%。但Hwang等［12］的研究顯示同樣臨床分期的患者對VBP方案的緩解率為66.2%。因此，提高機(jī)體對化學(xué)治療的敏感性仍是臨床亟待解決的問題。

增強(qiáng)腫瘤化療的敏感性，克服其耐藥性是腫瘤治療的重要領(lǐng)域之一。非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)在腫瘤化療方面打開了一扇新的窗戶。研究［13-15］表明，異常表達(dá)的microRNA能通過對耐藥相關(guān)靶基因的調(diào)控改變靶蛋白的表達(dá)水平，如miR-21［13］可靶向抑制BcL2蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，致使對化療不敏感;miR-214可靶向PTEN導(dǎo)致PTEN蛋白低表達(dá)，Akt通路過度激活從而促進(jìn)細(xì)胞增生，致使對順鉑不敏感［16］。此外miRNA基因多態(tài)性、表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)、靶基因3’UTR區(qū)的突變/多態(tài)性也可影響腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性。如DHFR基因的3UTR區(qū)發(fā)生829C→T的單堿基突變，干擾了miR-24與DHFR mRNA的正常配對，導(dǎo)致二氫葉酸還原酶水平升高，造成抗甲氨蝶呤表型［17-19］。本研究采用VP16與紫杉醇處理宮頸癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)兩組MiR-886-5p的表達(dá)呈升高趨勢。這提示MiR-886-5p可能與宮頸癌的化療耐藥相關(guān)，其確切的分子生物學(xué)機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

總之，MiR-886-5p在宮頸癌組織中高表達(dá)，負(fù)性調(diào)控P53通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)宮頸鱗狀上皮細(xì)胞的克隆形成，可能參與了宮頸癌化療的耐藥，其耐藥機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

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