肝刺激因子穩定轉染人肝癌細胞系的方法建立與表達鑒定

吳 媛 張 靜 董凌月 安 威

(首都醫科大學基礎醫學院細胞生物學系肝臟保護與再生調節北京市重點實驗室，北京100069)

肝臟是一種具有多樣而復雜的生物學功能的人體生命器官，具有很強的再生功能，肝損傷引起的肝細胞數量減少和肝部分切除均可啟動肝臟再生過程［1］。包括激素、生長因子以及細胞因子在內的多種物質均參與肝再生的調節，其中肝刺激因子(hepatic stimulator substance，HSS)目前受到廣泛的關注。HSS是1975年La Brecque從新生大鼠肝臟或鼠再生肝臟中分離到的一種活性物質，由于具有特異性刺激肝細胞增生的特點，故謂之肝刺激因子［2］。HSS已被證明是唯一具有肝特異性的細胞因子，廣泛存在于哺乳動物胚胎肝、幼胎肝以及再生肝胞漿液中，并且是由肝細胞自身分泌的［3］。除去上述的刺激肝細胞增生外，HSS還具有保護肝細胞免于CCl4、氨基半乳糖等毒物對肝臟的特異性損害［4-6］。它具有抗酸耐堿耐熱等特點并帶強負電荷(相對分子質量介于14 000～20 000)［7］。HSS作為肝細胞源性活性因子可能在肝再生過程中發揮重要調控作用，但具體機制仍不甚清楚。因此本研究利用本實驗室已構建成功的Flag-HSS-pcDNA3.0質粒，轉染BEL-7402細胞，建立了穩定表達HSS的細胞系，為深入研究HSS的生理功能提供實驗工具和研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

BEL-7402細胞系(首都醫科大學基礎醫學院細胞生物學系保存);高糖DMEM培養基(美國Hyclone公司);胎牛血清(美國Gibco公司);FuGENE HD轉染試劑(瑞士Roche公司);Mitotracker染劑(美國Molecular Probes公司);SYBR Green PCR Master Mix(德國GIAGEN公司);BCA蛋白質定量試劑盒(美國Thermo公司);化學發光試劑盒(美國Bio-Rad公司);HSS多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);Flag單克隆抗體(美國Sigma公司);辣根過氧化物酶標記的抗GAPDH抗體(上海康成公司);羊抗鼠IgG抗體-辣根過氧化物酶，羊抗兔IgG抗體-辣根過氧化物酶(北京普利萊公司)。

1.2 細胞培養

無菌條件下，在相對濕度95%、5%(體積分數)CO2、37℃恒溫二氧化碳培養箱中培養BEL-7402細胞(人原發性肝癌細胞系)，培養液為含體積分數為10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、含有青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的高糖 DMEM培養基。每24～48 h進行一次傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 穩定轉染

按FuGENE HD轉染試劑說明書的操作方法將Flag-HSS-pcDNA3.0(本室保存)轉染入BEL-7402細胞系中。轉染前1 d按3×105/mL的密度接種細胞于6孔培養板中，使細胞達到80% ～90%的匯合率。用無抗生素無血清的opti-MEM培養液稀釋質粒DNA(2 μg)至終體積100 μL;在培養基中加入4 μL脂質體，渦旋1～2 s，室溫15 min;將6孔板中的培養基棄去，換用新鮮無抗生素的10%(體積分數)FBS的DMEM培養基900 μL;加入含有質粒和轉染試劑的混合物100 μL，于5%CO2、37 ℃的條件下培養24 h 后，加入無抗生素含10%(體積分數)FBS的DMEM培養基2 mL。轉染24 h后按1∶5傳代，用600 μg/mL終質量濃度的G418進行篩選，約12～15 d后肉眼可見單克隆細胞團，挑取單克隆細胞團，用含有300 μg/mL G418的DMEM培養基進行擴大培養，之后收集細胞并分別提取轉染細胞和野生型細胞的蛋白質和mRNA，進行Western blotting和real-time PCR實驗。

1.4 免疫熒光(immunofluorescent，IF)

將厚為0.1 mm直徑為12 mm的蓋玻片放入24孔板，將野生型細胞和轉染細胞按2.5×105/孔接種于24孔板中，之后細胞貼壁于玻片上形成細胞爬片;用含10%(體積分數)FBS的完全培養基培養細胞24 h后，加入200 μL含 Mitotracker染劑的 PBS(終濃度200 nmol/L)，37℃孵箱中避光染色25 min;PBS洗滌并加入4%(質量分數)多聚甲醛，室溫固定細胞15 min;PBS洗滌，用 500 μL 0.2%(體積分數)TritonX-100通透細胞，用500 μL 5%(質量分數)BSA進行封閉30 min;每孔加入按1∶4 000稀釋的anti-Flag抗體，4℃過夜孵育;加入按1∶500稀釋的Alexa Flour 594熒光二抗，于室溫避光平緩搖動1 h;DIPA復染細胞核;用激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time PCR)

PCR反應擴增條件:50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，此條件進行40個循環。將所擴增得到的PCR產物同時進行溶解曲線分析。18 s的Tm為84℃，HSS的Tm為87℃。檢測的臨界點在PCR擴增過程中，熒光信號從本底進入指數增長階段時的拐點所對應的循環數(Ct)看作模板初始濃度的間接指標。結果用18 s進行校正。用ΔΔCt法計算相對基因表達，確定HSS mRNA相對定量。

1.6 Western blotting 分析

將細胞消化成單細胞懸液，在4℃條件下用細胞裂解液得到細胞蛋白，按 BCA蛋白檢測試劑盒中的方法進行蛋白定量，配制聚丙烯酰胺凝膠(5%濃縮膠和12%分離膠)，50 μg待測樣品與上樣緩沖液共25 μL混勻后，99℃ 加熱10 min使蛋白變性。然后按順序加待測樣品及預染蛋白標準品上樣，濃縮膠80 V，進入分離膠后改為120 V恒壓電泳約1.5 h。之后進行膜轉印，5% 封閉液(1.25 g脫脂奶粉+25 mL TBST配制)室溫封閉1 h，封閉結束后，將硝酸纖維膜放入按1∶5 000稀釋的一抗稀釋液中，搖床上4℃ 過夜;TBST沖洗3次，加入二抗(辣根過氧化物酶標記抗IgG抗體，1∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h后，TBST沖洗3次，進行化學發光顯色。洗膜后孵育內參GAPDH，結果用密度分析軟件進行分析。

1.7 統計學方法

應用SPSS 11.0對實驗結果進行統計學分析。計量數據使用均數±標準差(±s)表示，組間比較使用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 穩定轉染細胞系的篩選

Flag-HSS-pcDNA3.0轉染入BEL-7402細胞，經600 μg/mL G418維持篩選后，大約13 d后抗G418(圖1A)細胞初步形成單克隆，挑取單克隆細胞進行擴大培養;首先移至96孔板中，每孔1個單克隆細胞團，細胞覆蓋率80%以上時轉移至24孔板，如此依次擴大培養至12孔板、6孔板和60 mm培養皿中，期間保持每種單克隆細胞的獨立性，即不與其他克隆交叉(圖1B)。將最終獲得的細胞命名為HSS-expressing細胞。

圖1 穩定轉染細胞系的篩選Fig.1 Screening of stable transfected cell clones

2.2 免疫熒光染色觀察 HSS-expressing細胞中HSS的定位

野生型BEL-7402細胞和HSS-expressing細胞通過免疫熒光染色，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示(藍色熒光代表經DAPI染色的細胞核，紅色熒光代表經Mitotracker染色的線粒體，綠色熒光代表經Flag標記的HSS):在野生型的BEL-7402細胞中，只有紅色熒光線粒體而沒有綠色熒光Flag-HSS;而在HSS-expressing細胞中，既有紅色熒光線粒體又有綠色熒光HSS的表達，疊加后顯示黃色(圖2)，這些結構提示，成功將HSS基因整合入BEL-7402細胞的基因組中，HSS基因可以穩定表達并定位于線粒體中。

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察轉染HSS在BEL-7402細胞內表達及定位Fig.2 Expression and localization of HSS in BEL-7402 cells transfected HSS by confocal microscopic

2.3 HSS在穩定轉染細胞系中mRNA的表達

為了進一步鑒定HSS-expressing細胞中HSS的表達情況，提取細胞的總RNA后，進行real-time PCR試驗。結果顯示:野生型BEL-7402和HSS-expressing細胞中HSS基因均有表達，而 HSS-expressing細胞中HSS表達較野生型細胞顯著上調(圖3)。

圖3 HSS mRNA在穩定轉染細胞系中的表達Fig.3 Analysis of HSS mRNA expression in wild type cells and BEL-7402 cells transfected HSS

2.4 HSS在穩定轉染細胞系中蛋白質水平的表達

通過Western blotting方法進一步鑒定提取的野生型BEL-7402細胞和HSS-expressing細胞中HSS蛋白質表達和兩種細胞中帶Flag標簽的HSS融合蛋白的表達情況。如圖4A所示，HSS-expressing細胞中HSS蛋白質表達較野生型細胞增加了6.8倍;而帶Flag標簽的HSS融合蛋白在HSS-expressing細胞中表達同樣明顯高于野生型細胞(圖4B)。這些結果均提示，HSS在HSS-expressing細胞可以穩定的高表達，可用于下一步的HSS功能的研究。

3 討論

HSS又稱為肝再生增強因子(augmenter of liver regeneration，ALR 或 growth factor，augmenter of liver regeneration，GFER)［8-10］。從 1975 年發現至今，由于其在肝臟保護、促肝細胞增生及抑制凋亡等方面發揮重要作用，一直備受人們關注［11-14］。新近研究［15］顯示，利用條件性基因敲除技術，將肝臟內的HSS選擇性的沉默后，肝臟很快發生脂肪性變性，并在正常飼養下，逐步發展成肝臟纖維化及肝癌。HSS作為一種線粒體蛋白，如何影響肝臟脂質代謝，是目前HSS研究中需要解決的問題。

將基因克隆到真核表達載體中，轉染至宿主細胞，觀察宿主細胞的變化是研究基因功能及相關機制的一種有效方法。本研究應用陽離子脂質體介導法將重組質粒Flag-HSS-pcDNA 3.0成功轉染入人肝癌BEL-7402細胞后，選擇按1∶5的比例，進行第一次傳代。通過G418篩選13 d后，獲得了具有抗性的陽性單細胞克隆。在實驗中，同樣選擇了1∶4和1∶6的比例，雖然1∶4的傳代比例相對于1∶5的比例，出現細胞克隆更早且更多，但是由于細胞密度大，導致細胞克隆并非始于單個祖細胞，不利于后續實驗。而1∶6的比例，由于細胞過少，不容易生長出細胞克隆，增加了篩選的難度。這個比例的建立，增加了獲得陽性單細胞克隆的幾率，可用于其他穩定轉染實驗。

獲得了穩定轉染的HSS-expressing細胞系后，分別應用real-time PCR和Western blotting方法從轉錄和翻譯兩個水平鑒定此細胞系是否正確表達HSS，結果顯示HSS在穩定轉染細胞中可以被有效的轉錄和翻譯。由于選用的真核表達載體含有Flag標簽蛋白，本課題組還利用抗Flag標簽的抗體檢測細胞中HSSFlag融合蛋白的表達，結果證實了穩定轉染細胞系建立成功。應用免疫熒光技術，可以觀察單個細胞內基因的表達及分布。為此又進行了免疫熒光實驗，利用激光共聚焦顯微鏡可以觀察到，每個HSS-expressing細胞均有HSS的表達，且主要定位于線粒體中，與既往研究［16］相符，進一步證實了HSS-expressing細胞可以有效準確的表達HSS，并且具有良好的抗體結合活性，可以用于后續的研究。

綜上所述，本課題組成功的構建了HSS穩定表達的細胞系，為研究HSS的生物學功能及相關機制提供了良好的細胞模型及研究工具。

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