硝化應激參與衰老血管內(nèi)皮功能障礙

馬語曼 孫 琪 董 玉 王環(huán)愿 王 雯

(首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學與病理生理學系 首都醫(yī)科大學代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點實驗室，北京100069)

隨著人口老齡化進程的日益加速，多種心腦血管疾病發(fā)生率迅速上升。血管內(nèi)皮細胞功能紊亂是導致血管壁結(jié)構(gòu)和功能改變的重要原因，亦是血管衰老的主要特征之一，但其發(fā)生機制尚未完全清楚。硝化應激(nitrative stress)是指由一氧化氮(nitric oxide，NO)或由NO衍生的活性氮與活性氧共同聯(lián)合發(fā)生的生物化學作用，使蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基硝化成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)［1］，從而對細胞產(chǎn)生多種毒性作用。老年時NO大量生成，但血管內(nèi)皮的生物活性卻不斷下降，是否與硝化應激反應增強有關(guān)?本研究通過觀察硝化應激對衰老大鼠血管內(nèi)皮形態(tài)和功能的影響，探討衰老血管內(nèi)皮功能紊亂的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級3月齡(體質(zhì)量350～450 g)健康雄性SD(sprague dawley)大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為:SCXK(京)2012-0001。SPF級20月齡(體質(zhì)量620～750 g)健康雄性SD大鼠，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號為:SCXK(湘)2009-0012。

1.2 藥物與試劑

內(nèi)消旋-四(N-甲基-4-吡啶)卟啉五氯化鈉(Ⅲ)〔Fe(III)meso-tetra(N-methyl-4-pyridyl)porphine pentachloride，F(xiàn)eTMPyP，Cayman Chemical公司，美國〕;P53抗體和P21抗體(Abcam公司，美國);3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)抗體(Millipore公司，美國);β-actin、血管假性血友病因子(von willebrand factor，vWF)抗體、一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗體、山羊抗兔 IgG/生物素標記和山羊抗小鼠IgG/生物素標記(Santa Cruz公司，美國);鹽酸去氧腎上腺素注射液(phenylephrine hydrochloride，PE，上海禾豐制藥有限公司，中國);乙酰膽堿(acetylcholine，Ach，Sigma-Aldrich 公司，美國);Hepes(Sigma-Aldrich，美國);小鼠超敏二步法檢測試劑盒購自中山金橋公司;NaCl、KCl、MgCl2、Glucose、CaCl2等普通試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 儀器

微血管張力檢測系統(tǒng)(Myo Technology A/S公司，丹麥);PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(ADInstruments公司，澳大利亞);石蠟包埋機，石蠟切片機(Leica公司，德國;Western blotting電泳儀，Western blotting電轉(zhuǎn)儀，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及給藥

3月齡和20月齡兩個年齡段健康雄性SD大鼠(SPF級)各12只，采用隨機數(shù)字表法分組如下:①青年對照組(3月齡對照組);②青年+過氧亞硝基(peroxynitrite，ONOO-)清除劑組(FeTMPyP，3 月齡);③老年對照組(20月齡對照組);④ 老年+過氧亞硝基清除劑組(FeTMPyP，20月齡)。實驗期間自由進食進水。用0.9%氯化鈉注射液溶解FeTMPyP，配制成1 mg/mL的FeTMPyP溶液。采用腹腔注射的給藥方式，劑量為3 mg/kg。每3天1次，共5次。對照組給予0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液。

1.4.2 Western blotting分析蛋白表達

取凍存肝臟組織按(組織 ∶RIPA裂解液 ∶蛋白酶抑制劑=100 mg∶1 mL∶10 μL)比例加入到1.5 mL EP管中，置冰上用眼科剪剪碎組織。4℃，12 000 r/min，離心10 min，吸取上清至一干凈的EP管中，BCA法檢測蛋白，于樣品中加入5×SDS-PAGE Loading buffer，99℃煮沸10 min，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鹘M取40 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，250 mA，90 min蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h。一抗 P53或 P21(1∶1 000)和 β-actin(1∶500)分別4℃孵育過夜。次日取出，TBST洗膜3次。加入山羊抗小鼠IgG/生物素標記的二抗或山羊抗兔IgG/生物素標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。用Bio-rad凝膠成像分析儀發(fā)光及分析結(jié)果。

1.4.3 離體胸主動脈血管環(huán)的制作及血管功能的檢測

處死動物后，剪開胸腔，迅速游離胸主動脈，置于盛有4℃預冷的Hepes液中，眼科剪小心去除動脈周圍多余結(jié)締組織，將胸主動脈剪成約2 mm的血管環(huán)，期間應該避免過度牽拉和損傷血管內(nèi)皮。將血管環(huán)固定在張力測定系統(tǒng)中。通過逐步標準化將血管初始張力調(diào)到與100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)壓強時一致，此初始張力在整個實驗過程中保持穩(wěn)定不變。浴槽中持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體，37℃恒溫。平衡之后，給予濃度為60 mmol/L高鉀Hepes液預收縮血管。使用Hepes液將高鉀溶液洗脫平衡后，給予去氧腎上腺素(phenylephrine，PE)(10-5mol/L)刺激血管環(huán)使其收縮，待血管收縮穩(wěn)定后，以累積給藥的方式給予10-9～10-5mol/L的乙酰膽堿(Ach)，待累積反應穩(wěn)定后，沖洗、平衡至基礎(chǔ)張力，開始下一輪實驗。分別記錄每個濃度Ach刺激血管穩(wěn)定后的張力，并計算舒張率。舒張率(%)=(10-5mol/L PE刺激血管獲得的最大張力-10-9～10-5mol/L Ach刺激血管最大張力)/(10-5mol/L PE刺激血管獲得的最大張力-基礎(chǔ)張力)×100%。

1.4.4 免疫組織化學染色

處死動物后，迅速剪取一段胸主動脈用預冷的0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液洗滌干凈后置于4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛溶液充分固定。經(jīng)過從低到高的梯度乙醇脫水，二甲苯透明，不同熔點石蠟透蠟，高熔點石蠟進行包埋后，按5 μm厚度切片，放入40℃溫水中展平，60℃烤24 h，自然冷卻至室溫備用。將載玻片置于梯度二甲苯、乙醇脫蠟，PBS沖洗后置于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，微波高火加熱3 min，低火加熱15 min，冷卻至室溫。3%(質(zhì)量分數(shù))H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加一抗，4℃，靜置過夜。次日，取出載玻片，PBS沖洗，使用小鼠超敏二步法檢測試劑盒，37℃孵育聚合物輔助劑、辣根酶標記抗小鼠IgG聚合物各15 min。DAB混合液顯色1 min，蘇木精染液染色1 min使細胞核著色，使用含有1%(體積分數(shù))鹽酸的乙醇脫去非特異性染色。梯度乙醇二甲苯脫水，樹脂封片，顯微鏡觀察，對多個視野不同放大倍數(shù)拍照。

圖1 20月齡大鼠衰老相關(guān)蛋白P53/P21表達明顯升高Fig.1 Expression of aging-related proteins P53 and P21 in liver were increased significantly in aging rats

1.4.5 HE染色

將載玻片置于梯度二甲苯、乙醇脫蠟，PBS沖洗。蘇木精染液染色1 min使細胞核著色，用含1%(體積分數(shù))鹽酸的乙醇脫去非特異性染色，0.5%伊紅染色2 min。梯度乙醇二甲苯脫水，樹脂封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(±s)表示。組間的檢驗采用析因方差分析(factorial ANOVA)或重復測量數(shù)據(jù)方差分析(repeated measurement data ANOVA)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 20月齡大鼠衰老相關(guān)蛋白P53和P21表達升高

通過Western blotting方法檢測了衰老標志蛋白P53和P21。結(jié)果顯示，與3月齡動物相比，20月齡大鼠肝臟中P53和P21表達量均有顯著增加(分別P＜0.001，圖1)。

2.2 衰老大鼠血管組織硝化應激反應明顯增強

過氧亞硝基是NO與超氧陰離子結(jié)合生成的產(chǎn)物，可以硝基化蛋白質(zhì)上酪氨酸等氨基酸，形成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)。3-NT通常用來反映體內(nèi)硝化應激的水平。本研究使用免疫組化的方法檢測了胸主動脈3-NT的表達。結(jié)果顯示，20月齡大鼠胸主動脈3-NT高于3月齡組(圖2)，這提示衰老血管中出現(xiàn)明顯的硝化應激反應;采用過氧亞硝基的清除劑FeTMPyP干預可明顯降低3-NT。

圖2 胸主動脈3-NT免疫組織化學染色Fig.2 Immunohistochemistry staining of 3-nitrotyrosine(3-NT)in thoracic aorta

2.3 抑制硝化應激反應可改善衰老血管內(nèi)皮依賴性舒張功能

為了檢測衰老血管內(nèi)皮功能的改變，觀察了胸主動脈對乙酰膽堿(Ach)的舒張反應。

20月齡衰老大鼠胸主動脈(圖3)內(nèi)皮依賴性舒張功能較3月齡大鼠相比顯著下降。采用過氧亞硝基的清除劑FeTMPyP干預可明顯減輕衰老血管內(nèi)皮依賴性舒張功能。

2.4 抑制硝化應激反應可減輕衰老血管形態(tài)學損傷

HE染色結(jié)果示20月齡衰老大鼠胸主動脈較3月齡大鼠均出現(xiàn)較明顯的損傷，胸主動脈內(nèi)皮標志物血管假性血友病因子(von willebrand factor，vWF)及eNOS免疫組織化學染色示動脈內(nèi)膜連續(xù)性破壞，部分血管內(nèi)皮細胞丟失，著色較淺，連接間隙增大;采用過氧亞硝基的清除劑FeTMPyP干預可明顯減輕衰老血管形態(tài)學損傷，詳見圖4。

圖3 胸主動脈血管內(nèi)皮依賴性舒張功能Fig.3 The endothelium-dependent diastoliation of thoracic aorta

3 討論

本課題在在體水平研究了硝化應激在衰老所致血管內(nèi)皮損傷中的作用。本研究顯示衰老時機體的硝化應激增加，可能參與衰老血管形態(tài)學損傷和血管內(nèi)皮依賴性舒張功能降低。

衰老是全世界面臨的一個重大挑戰(zhàn)。在中國，人口老齡化的形勢尤為嚴峻。衰老的表現(xiàn)是全身性的，全身所有器官在衰老時其功能均發(fā)生減退。由于血管肩負向全身供血的功能，它的衰老同時促進著其他器官的功能障礙，尤其是心腦等重要器官，因而血管的衰老引起人們的格外關(guān)注。

血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelium cells，VECs)是血管內(nèi)腔表面的連續(xù)單層扁平細胞，由胚胎時期的中胚層分化而來。正常成人約有1×1012個VECs，不僅構(gòu)成了血液與血管平滑肌之間的生理屏障，同時還具有重要的內(nèi)分泌功能，可合成和釋放多種內(nèi)皮衍生的血管活性因子。Ach可以作用于血管內(nèi)皮細胞，刺激血管內(nèi)皮細胞釋放舒張血管物質(zhì)，如NO，最終導致血管舒張［2］。因此，Ach誘導的內(nèi)皮依賴性舒張可以用來反映內(nèi)皮調(diào)節(jié)平滑肌舒張活動的能力。VECs結(jié)構(gòu)和功能的完整對維持心血管系統(tǒng)正常穩(wěn)態(tài)有著重要的意義。內(nèi)皮作為生理上防御動脈粥樣硬化的“第一線”，各種物理、化學因素、炎性反應及免疫反應等因素均可影響血管內(nèi)皮增生活性，引起內(nèi)皮細胞凋亡、脫落，導致血管內(nèi)皮損傷，進而影響血管內(nèi)皮正常的生理功能，最終導致一系列心血管事件的發(fā)生。目前認為，內(nèi)皮功能障礙是各種心血管疾病發(fā)生的始動環(huán)節(jié)［3］。已有研究顯示衰老是一種引起血管內(nèi)皮功能障礙的危險因素［4］，同時很多文獻報道了衰老器官中 ONOO-增加的現(xiàn)象，比如心臟［5］、肝臟［6］、腎［7］和腦［8］等。ONOO-在衰老機體廣泛的分布源于衰老器官誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)表達升高以及衰老機體氧化應激水平升高。ONOO-是參與硝化應激的重要活性氮(reactive nitrogen species，RNS)之一，雖然 ONOO-極不穩(wěn)定，不易被直接檢測到，但其可與蛋白質(zhì)酪氨酸殘基或游離酪氨酸發(fā)生硝化反應生成3-NT，目前以3-NT來代表體內(nèi)ONOO-生成的印跡。本實驗中，通過 Western blotting方法檢測了衰老標志蛋白P53和P21。與3月齡動物相比，20月齡大鼠肝臟中P53和P21表達量均有顯著增加，表明本課題組所選用的自然衰老動物模型是可信的。應用免疫組織化學法測定胸主動脈中3-NT的表達，發(fā)現(xiàn)相對于3月齡大鼠，20月齡大鼠胸主動脈3-NT的表達明顯增加，提示20月齡大鼠出現(xiàn)明顯的硝化應激反應。FeTMPyP是一種水溶性的金屬卟啉類化合物，通過催化ONOO-轉(zhuǎn)化為硝酸鹽(＞90%)而減輕其毒性，對機體起保護作用。已有報道［9］顯示，F(xiàn)eTMPyP可改善糖尿病大鼠的腎臟功能、減輕順鉑誘導的腎損傷及離體細胞中ONOO-的毒性反應等。研究［10］表明，F(xiàn)eTMPyP可特異性作用于ONOO-，且對NO和O2-并無影響。本課題組的實驗結(jié)果顯示，通過使用FeTMPyP腹腔注射對20月齡大鼠進行抗硝基化干預后，血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)損傷減輕，血管內(nèi)皮依賴性舒張功能得到改善。本研究通過觀察自然衰老大鼠中硝化應激對血管內(nèi)皮形態(tài)和功能的影響，初步表明衰老時增強的硝化應激參與了血管內(nèi)皮損傷。而衰老時增強的硝化應激反應對內(nèi)皮細胞損傷的具體機制尚需進一步探討。

圖4 胸主動脈HE染色，內(nèi)皮標志物vWF和eNOS免疫組織化學染色Fig.4 HE staining of thoracic aorta and immunohistochemistry staining of endothelium marker vWF and eNOS in thoracic aorta

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