帕金森病相關基因α-突觸核蛋白和PINK1對Nurr1的調節作用

魯玲玲 施予晴 魏雨菲 賈煥珍 喬芳偉 楊 慧

(首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系 北京市腦重大疾病研究院 北京市神經再生修復研究重點實驗室神經變性病教育部重點實驗室，北京100069)

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)由 140 個氨基酸構成，主要在中樞神經系統的突觸前末梢和細胞核內表達。它與帕金森病(Parkinson’s disease，PD)密切相關。首次將α-syn與PD聯系起來的是Polymeropou-los與Krüger的研究小組，他們發現α-syn的錯義突變(A53T與A30P)可導致常染色體顯性遺傳性PD［1-2］。并且它還是PD特征性病變-路易體(Lewy bodies，LBs)與路易神經突(Lewy neurites)的主要成分［3-8］。對αsyn轉基因果蠅和大鼠的研究［9-10］顯示，過量的α-syn會導致大鼠與果蠅腦內黑質多巴胺(dopamine，DA)能神經元丟失。在猴腦的黑質部位過表達α-syn基因，也取得了類似的結果。有意思的是，過表達α-syn并不影響非DA能神經元。那么，α-syn是如何導致DA能神經元的選擇性丟失的呢?迄今為止，該問題仍無確切答案。但是，根據DA神經元內神經遞質DA獨特的合成、分解、儲存與重攝取過程。這種選擇性損傷很可能與DA穩態有關。而研究［11-15］表明，α-syn在多巴胺的合成、儲存、釋放與重攝取中起重要作用，即α-syn與DA穩態維持關系密切。

PTEN誘導的蛋白激酶1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1)突變后可導致常染色體隱性遺傳性PD。研究［6］顯示 PINK1 是除了 α-syn、synphilin-1 以外的第三種參與LB體和細胞質內含物的蛋白，包括尸檢的LBs體中同時檢出PINK1和α-syn。PINK1與PD發病關系密切，亦是眾多研究者關注的焦點。但其確切的功能與突變后致病機制仍不清楚。在果蠅模型中，PINK1突變可以引起部分腦區酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性神經元的減少，以及DA的減少［16-17］。在斑馬魚模型中，PINK1功能缺失同樣可以引起TH陽性神經元及DA下降［18-19］。表明PINK1也與DA神經元內DA穩態的維持有關。

核受體相關因子1(nuclear receptor related 1，Nurr1)，是在中腦部位高豐度表達的轉錄因子。其調控的靶基因包括TH、多巴脫羧酶(L-DOPA decarboxylase，DDC)、DA 轉運體(dopamine transporter，DAT)與單胺囊泡轉運體2(vesicular monoamine transporter 2，VMAT-2)。而TH與DDC是DA合成所需要的酶，DAT負責重攝取被釋放至突觸間隙的DA，VMAT-2則負責將胞質內DA攝取并儲存至突觸囊泡中。由此可見，Nurr1與DA穩態維持關系密切。

α-syn、PINK1與Nurr1這3個與DA穩態維持關系密切的相關分子，目前關于它們之間關系的研究未見報道。那么，α-syn與PINK1是否通過與Nurr1的作用而參與DA穩態維持呢?為解答上述問題，利用熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技術檢測了α-syn與Nurr1之間的相互作用，并在PINK1基因敲減的MN9D細胞模型中檢測PINK1對Nurr1活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人源神經母細胞瘤細胞系(SK-N-SH)，美國ATCC公司(貨號HTB-11TM)。MN9D細胞(小鼠多巴胺能神經母細胞瘤細胞株)由瑞士Novartis公司惠贈。質粒 pAmCyan1-N1-α-syn(CFP-α-syn)與 pZsYellow1-N1-Nurr1(YFP-Nurr1)由本室構建。DMEM培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購于美國Gibco公司;RIPA裂解液購于北京普利萊基因有限公司;蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購于美國Merck公司;脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000購于美國Invitrogene公司。

1.2 細胞培養與基因轉染

SK-N-SH細胞采用含10%(體積分數)胎牛血清DMEM培養基。MN9D細胞采用含10%(體積分數)新生牛血清的DMEM培養基。細胞置于37℃，5%(體積分數)CO2培養箱中培養。其中SK-N-SH細胞分別轉染CFP-α-syn與YFP-Nurr1等質粒，用于FRET檢測。MN9D細胞則轉染針對PINK1設計的小干擾RNA片段以敲減 PINK1。小干擾 RNA片段如下:PINK1 5’GGAGCAGTTACTTACAGAAGA3’，Scramble:5’GGATTGATTCAACACGGAAGA3’，轉染方法按照Lipofectamine 2000操作說明書進行。

1.3 激光共振能量轉移

將重組融合蛋白真核表達質粒CFP-α-syn、YFPNurr1分別或等比例混合轉染SKN-SH細胞，轉染24 h后用激光共聚焦顯微鏡檢測FRET;轉染方法同前。

實驗共分9組:①單獨轉染CFP空載體的SKNSH細胞(CFP，校正組，用于校正光譜串擾);② 單獨轉染YFP空載體 的SKN-SH細胞 (YFP，校正組，用于校正光譜串擾);③共轉染CFP空載體與YFP空載體的SKN-SH細胞(CFP/YFP，陰性對照組);④ 單獨轉染 CFP-α-syn 的 SKN-SH 細胞(CFP-α-syn，校正組，用于校正光譜串擾);⑤單獨轉染YFP-Nurr1的SKNSH細胞(YFP-Nurr1，校正組，用于校正光譜串擾);⑥共轉染 CFP-α-syn與 YFP空載體的 SKN-SH細胞(CFP-α-syn/YFP，實驗對照組);⑦ 共轉染CFP空載體與YFP-Nurr1的SKN-SH細胞(CFP/YFP-Nurr1，實驗對照組);⑧ 共轉染 CFP-α-syn和 YFP-Nurr1的SKN-SH 細胞(CFP-α-syn/YFP-Nurr1，實驗組);⑨ 單獨轉染陽性對照質粒CFP-YFP的SKN-SH細胞(CFP，YFP，陽性對照組)。

CFP-α-syn作為FRET供體，YFP-Nurr1融合蛋白作為受體;用對照組樣品調整參數，首先設定供體熒光掃描參數:激發光的波長405 nm，光電倍增管(PMT)1對應發射光波長為475 nm，PMT2對應發射光波長為527 nm;設定受體熒光掃描參數:激發光波長514 nm，PMT2產生激發供體的圖像，調整激發光的強度以及PMT增益，獲得理想的熒光圖像。用實驗組樣品進行檢測，激發供體熒光，同時檢測供體和受體的熒光，并應用激光共聚焦顯微鏡提供的軟件計算FRET效率，計算公式如下:E=R06/(R6+R06)，R是供體與受體在生物條件下的距離，R0是每對供受體之間的一個常數，代表能量轉移的效率為50%時的距離。

1.4 雙熒光素酶法(dual luciferase assay)檢測Nurr1轉錄激活活性

相應組別的MN9D細胞分別共轉染phRL-TK質粒和其他各種目的質粒(空啟動子的pGL3-Basic作陰性對照，pGL3-Control質粒作陽性對照)。轉染細胞培養48 h后用200 μL的 PBS緩沖液洗滌2遍，40 μL雙熒光報告分析系統中的細胞裂解液裂解，室溫輕柔振搖15 min，-80℃保存待檢。所有待檢樣本室溫融化，每空加入100 μL檢測液Ⅱ，用TD-20/20熒光分析儀檢測螢火蟲熒光素酶活性。接著在每孔中加入100 μL反應終止液，同樣用TD-20/20熒光分析儀檢測海腎熒光素酶活性。用公式計算相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.5 統計學方法

應用SPSS 11.5統計軟件包進行數據分析，所有數值用均數±標準差(±s)表示，組間比較用ANOVA進行分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CFP-α-syn與YFP-Nurr1質粒載體的構建與酶切鑒定

α-syn及Nurr1的PCR產物分別經BglⅡ/SalⅠ和XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切，分別插入經過同樣雙酶切的pZsYellow1-N1及pAmCyan1-N1真核表達載體，連接后轉染感受態細胞DH5α，小提酶切經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下觀察，結果顯示獲得條帶大小分別為420 bp和1 800 bp，與目的基因大小相符。(圖1)初步表明CFP-α-syn和YFP-Nurr1的融合蛋白真核表達質粒連接正確。進一步對載體進行測序，結果顯示插入片段的序列與目的基因完全吻合。證明成功構建了進行FRET檢測所需要的質粒載體。

圖1 重組質粒酶切鑒定結果Fig.1 Identification of the recombinant plasmids of pAmCyan1-N1-α-syn and pZsYellow1-N1-Nurr1

2.2 CFP-α-syn與YFP-Nurr1熒光融合蛋白在SKN-SH細胞中表達

在脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000介導下，將上述構建的CFP-α-syn與YFP-Nurr1質粒分別轉染SK-N-SH細胞。24 h后分別在Confocal激光共聚焦顯微鏡下檢測CFP與YFP的熒光強度，結果顯示CFP-αsyn與YFP-Nurr1均可很好地在細胞內表達，且二者的熒光強度較強，并未因融合了目的蛋白而出現熒光減弱的現象。此外，α-syn在胞質胞核均有分布，而Nurr1的分布以胞核為主。二者在亞細胞分布上存在共定位，有發生相互作用的基礎。詳見圖2。上述結果表明本課題組具備了FRET檢測的工作條件。

2.3 FRET檢測結果提示α-syn與Nurr1之間可能存在相互作用

FRET結果顯示:CFP組、CFP-α-syn組均可見到CFP(青色)熒光表達;CFP-α-syn的熒光分布如前所述，在胞質胞核均有分布;轉染YFP、YFP-Nurr1的細胞亦有熒光表達，為了區別FRET通道的黃色熒光，用紅色熒光代替，其熒光主要分布在細胞的胞核中;而共轉染 CFP和 YFP、CFP-α-syn和 YFP-Nurr1及單轉染CFP-YFP的細胞可同時檢測到青色熒光蛋白和 紅色熒光蛋白。

圖2 CFP-α-syn和YFP-Nurr1在SK-N-SH細胞中表達Fig.2 Expression of the reconstructed plasmids in SK-N-SH cells

用激發光波長為405 nm、發射光為475 nm的激光檢測共轉染CFP-α-syn和YFP-Nurr1的細胞獲得青色熒光圖像;用激發光波長為514 nm、發射光波長為527 nm的激光檢測共轉染CFP-α-syn和YFP-Nurr1的細胞獲得紅色(替代黃色)熒光圖像;參數(激發光的激發強度和PMT值)不變，用激發光波長為405 nm激發，可檢測到黃色熒光強度增強(圖3)。計算其FRET發生效率，陰性對照組為2%，實驗對照組CFP-α-syn/YFP組與CFP/YFP-Nurr1組分別為4.41%與6.95%，而 CFP-α-syn和 YFP-Nurr1的 FRET效率為20.52%，與上述對照組相比差異具有統計學意義(P＜0.01)。提示有FRET現象的發生，詳見圖3。

2.4 成功制備PINK1表達沉默的MN9D細胞模型

轉染PINK1小干擾RNA 24 h和48 h后，分別提取全細胞蛋白，用Western blotting方法檢測PINK1蛋白表達。結果顯示在RNA干擾24 h后，轉染干擾片段的MN9D細胞(knock down組，簡稱KD組)，其蛋白表達較未作任何處理的MN9D細胞(簡稱N)或轉染無關系列對照組(簡稱Con組)均明顯降低(P＜0.01)。RNA干擾48 h后，KD組PINK1蛋白表達較N組或Con組均顯著降低(P＜0.01)，干擾效率高達70%，詳見圖4。

2.5 在 MN9D細胞中，PINK1基因被敲減后，其Nurr1的轉錄激活活性出現一定程度下調

在RNA干擾24 h和48 h后，分別進行雙熒光素酶活性檢測。結果顯示，在PINK1基因被干擾(KD組)24 h后，其熒光素酶活性(反映Nurr1轉錄激活活性)下降至約44%;PINK1基因被干擾48 h后，熒光素酶活性下降至約42%。與未處理MN9D細胞及對照組相比，差異具有統計學意義(P＜0.01)說明PINK1對于 Nurr1的轉錄激活活性具有一定的調節作用(圖5)。

圖3 CFP-α-syn和YFP-Nurr1之間FRET分析Fig.3 FRET efficiency analysis

圖4 PINK1干擾效率檢測Fig.4 Western blotting analysis to evaluate the efficiency of RNAi

圖5 雙熒光素酶活性檢測Fig.5 Dual luciferase assay

3 討論

在本研究中，本課題組利用FRET技術檢測αsyn與Nurr1之間相互作用。FRET是一個依賴于供體和受體間空間距離的偶極非輻射過程，該技術可以準確靈敏地反映1 nm～10 nm范圍的空間距離的變化［20-22］。由于FRET效率依賴于供體受體分子間空間距離6次方的倒數，所以FRET技術成為研究生物單分子間相互作用及其構像變化的重要技術之一［23-24］。隨著探測技術和分子生物學技術的發展，特別是綠色熒光蛋白及其突變體的發現和改進，使得FRET技術也成為在單個活細胞中實時長時間追蹤單分子動態行為特征的主要技術之一。

將目的蛋白α-syn與Nurr1分別與CFP與YFP相融合形成融合蛋白。在Confocal激光共聚焦顯微鏡下檢測，觀察到了FRET現象的發生。經過計算其FRET效率約為21%。這提示α-syn與Nurr1之間可能存在直接相互作用。但是，如要確定二者的作用可能還需要免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)、GST Pulldown或酵母雙雜交等的進一步驗證。

有研究［25-26］表明，過表達α-syn可抑制 TH與芳香族氨基酸脫羧酶(aromatic acid decarboxylase，AADC)的表達，因此推測α-syn可能作為一個轉錄抑制子，通過與Nurr1相互作用而抑制其活性，進而導致其下游靶基因TH與AADC(DDC)降低。

對于PINK1基因敲減的MN9D細胞模型研究發現，伴隨著PINK1被敲減，其Nurr1轉錄激活活性降低。表明正常情況下，PINK1對Nurr1應具有正性調控作用。這與之前的一些報道［16-19］，認為PINK1突變或功能缺失后，其DA降低的觀點是一致的。這種作用可能是PINK1通過對Nurr1活性的調節所導致的。

有研究［27-28］報道顯示 PINK1可調節 α-syn的表達和蛋白的聚集。PINK1突變導致的PD患者的成纖維細胞中，實時定量RT-PCR結果顯示α-syn上調了5倍以上［29］;在SH-SY5Y細胞中共轉染α-syn和PINK1的干擾片段，熒光顯微鏡下可以看到明顯的α-syn聚集。而本課題組的前期研究，通過 Co-IP、FRET及GST pulldown的方法證明PINK1與α-syn之間可能存在相互作用。這提示二者對于Nurr1的調節可能也存在相互協調相互制約的作用。PINK1對Nurr1是正性調節，α-syn是負性調節作用。二者之間可能通過多種途徑相互制約，相互平衡，從而維持Nurr1功能在一個正常生理水平，并最終參與維持DA的穩態。

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