腹腔內注射脂多糖對大鼠黑質多巴胺能神經元和小膠質細胞形態學影響及炎性因子變化

白麗娟 任 艷 羅曉光 姜 新 陳曉虹

(1.遼寧省人民醫院神經內科，沈陽110016;2.中國醫科大學附屬第一醫院神經內科，沈陽110001)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常見的中樞神經系統變性疾病，其主要病理變化表現為黑質內多巴胺(dopamine，DA)能神經元選擇性丟失，紋狀體中的神經遞質多巴胺和乙酰膽堿之間的相互拮抗作用失調而導致。自1988年，McGeer等［1］在帕金森病患者中的中腦黑質致密帶(pars compacta of substantia nigra，SNpc)中發現了激活的小膠質細胞，從此開始，以小膠質細胞激活為特征的神經免疫炎性反應機制受到關注。

免疫系統與神經系統之間存在雙向信息交流，尤其在腦內存在廣泛的神經元-膠質細胞信息網絡［2］。小膠質細胞作為腦組織中固有的免疫效應細胞，在中樞神經系統(central nervous system，CNS)受損時，可從靜止變為激活狀態，有助于宿主防御和修復［3］;但當機體受到外周免疫刺激時，小膠質細胞的改變與神經元的關系卻有待進一步研究。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細菌的細胞壁組成成分，在免疫應答研究中常被作為一種多克隆免疫激發劑來模擬機體免疫激發狀態。LPS是小膠質細胞的特異性強激活劑，只在小膠質細胞存在的情況下才對多巴胺能神經元有毒性作用。本實驗單次給不同年齡的斯普雷格-道利(Sprague-Dawley，SD)大鼠腹腔注射LPS，利用免疫組織化學方法觀察小膠質細胞和多巴胺能神經元在黑質的變化及炎性因子的變化，并比較老齡對其變化的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

取健康SD雄性大鼠，共216只，中國醫科大學動物實驗部門提供，實驗動物許可證號:SCXK(遼):72013-0001。分為實驗青年組及老年組，對照青年組及老年組4組。實驗青年組70只，為雄性2月齡(體質量250～350 g);實驗老年組70只，為雄性12月齡(體質量450～600 g);對照組中，青、老年鼠各38只。

各組又根據腹腔注射LPS或腹腔注射0.9%(質量分數)氯化鈉注射液后大鼠處死的不同時間點采用數字表法隨機分為5個亞組:即6 h，12 h，24 h，48 h及1周亞組。其中，實驗青年組和實驗老年組各有40只接受免疫組織化學染色，另外30只接受酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測;對照青年組和對照老年組各有8只接受免疫組織化學染色，另外30只接受ELISA檢測。

1.2 方法

實驗組均給予腹腔注射LPS 1 mg/kg，對照組均給予腹腔注射0.9%(質量分數)氯化鈉注射液1 mg/kg。

多巴胺能神經元及活化小膠質細胞免疫組織化學染色變化的觀察:各組大鼠分別于給藥后6 h、12 h、24 h、48 h及1周時進行心臟灌流、取腦，石蠟切片進行免疫組化染色，于顯微鏡下(100×)觀察多巴胺能神經元抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)的變化，于顯微鏡下(400×)觀察活化小膠質細胞抗鈣離子結合蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1)染色效果。每個標本隨機取3張切片，計算每視野下多巴胺能神經元及活化小膠質細胞數目。

血漿及腦脊液標本收集及相應標本腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素 6(interleukin 6，IL-6)及白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)水平的測定:以10%(質量分數)水合氯醛(即10 g水合氯醛+100 mL 0.9%(質量分數)氯化鈉注射液)麻醉大鼠。將大鼠頭部固定與身體成大約135°角，在枕骨嵴下凹陷處進針大約0.5 cm抵達小腦延髓池，緩慢抽取腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)。快速斷頭殺鼠，用置于冰上乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)化的試管收集小鼠血漿。ELISA法測定腦脊液標本及血標本中TNF-α、IL-6及IL-1β濃度，計算出相應的濃度。

1.3 統計學方法

SPSS 15.0軟件對數據進行析因方差分析法，計量數據用均數±標準差(±s)表示，以P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 實驗結果

2.1 多巴胺能神經元(TH染色陽性細胞)計數

腹腔注射脂多糖12 h后，實驗老年組多巴胺能神經元開始明顯減少(P＜0.05)，而實驗青年組于24 h后出現多巴胺能神經元數目明顯減少(P＜0.05)，即實驗老年組多巴胺能神經元數目減少早于實驗青年組;12 h后各時間點老年組多巴胺能神經元數量均少于青年組，差異有統計學意義(P＜0.05)，詳見圖1。

圖1 多巴胺能神經元(TH染色陽性細胞)數目的定量分析Fig.1 Quantitative analysis of dopaminergic neurons(TH positive cells)

2.2 活化小膠質細胞(Iba1染色陽性細胞)計數

實驗老年組與實驗青年組大鼠活化小膠質細胞的數量高峰均在24 h，兩組差異有統計學意義(P＜0.05);各時間點實驗老年組活化小膠質細胞數量多于實驗青年組，但是僅在6 h差異有統計學意義(P＜0.05)，詳見圖 2。

2.3 多巴胺能神經元(TH染色陽性細胞)形態學變化

腹腔注射LPS后，實驗青年組與實驗老年組大鼠黑質內多巴胺能神經元胞體變小，密度減小，1周時最明顯;在相同時間點，實驗老年組比實驗青年組大鼠多巴胺能神經元胞體變化更為顯著(圖3)。

圖2 活化小膠質細胞(Iba1染色陽性細胞)數目的定量分析Fig.2 Quantitative analysis of activiated microglia(Iba-1 positive cells)

圖3 多巴胺能神經元免疫組化染色情況Fig.3 Immunohistochemical staining of dopaminergic neurons(100×)

2.4 小膠質細胞(Iba1染色陽性細胞)形態學變化

實驗青年組大鼠黑質Iba1染色陽性細胞在12 h及以前呈現為分枝狀，細胞體小，突起細長，提示處在“靜止期”;24 h以后表現為桿狀、粗大分枝狀或胞體呈串珠、球狀改變，胞體變大，突觸縮短，且數量明顯增多，且這種改變以24 h最明顯;1周時Iba1染色陽性細胞形態恢復為“靜止期”狀態。實驗老年組大鼠黑質Iba1染色陽性細胞數量變化與青年實驗組大致相同，但出現胞體變大、突觸縮短等形態學變化較青年實驗組要早(圖4)。

圖4 小膠質細胞免疫組化染色情況Fig.4 Immunohistochemical staining of microglia(400×)

2.5 血漿中 TNF-α、IL-6和 IL-1β等炎性因子的濃度

實驗老年組和實驗青年組血漿中TNF-α、IL-6和IL-1β濃度隨時間延長而逐漸下降，其中12 h下降趨勢更明顯，之后趨于平穩;而且在6 h、12 h、24 h及48 h實驗組均高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，然而到達1周時實驗組與對照組血漿中TNF-α、IL-6和IL-1β含量趨于一致，差異無統計學意義(P＞0.05);相同時間點實驗老年組TNF-α、IL-6和IL-1β含量均略高于實驗青年組，差異無統計學意義(P＞0.05)(圖5～7)。

圖5 血漿中TNF-α濃度的定量分析Fig.5 Quantitative analysis of TNF-α in blood plasma

圖6 血漿中IL-6濃度的定量分析Fig.6 Quantitative analysis of IL-6 in blood plasma

圖7 血漿中IL-1β濃度的定量分析Fig.7 Quantitative analysis of IL-1β in blood plasma

2.6 腦脊液中TNF-α 濃度

老年組與青年組相比，老年組TNF-α濃度相對較高，只有對照組6 h差異有統計學意義(P＜0.05)，其余組差異均無統計學意義(P＞0.05);實驗組均高于對照組，且差異有統計學意義(P＜0.05);對照老年組各個時間點與對照老年組6 h相比，差異無統計學意義(P＞0.05);對照青年組各個時間點與對照青年組6 h相比，差異無統計學意義(P＞0.05);實驗老年組各個時間點與實驗老年組6 h相比，只有實驗組12 h差異有統計學意義(P＜0.05)，其余組差異均無統計學意義，TNF-α在12 h達到最高，之后并逐漸下降;實驗青年組各個時間點與實驗青年組6 h相比，差異無統計學意義(P＞0.05)，TNF-α在12 h達到最高，之后并逐漸下降(圖8)。

2.7 腦脊液中IL-6濃度

老年組與青年組相比，老年組IL-6濃度相對較高，只有對照組6 h差異有統計學意義(P＜0.05)，其余組差異均無統計學意義(P＞0.05);實驗組均高于對照組，且差異有統計學意義;對照老年組各個時間點與對照老年組6 h相比，差異無統計學意義(P＞0.05);對照青年組各個時間點與對照青年組6 h相比，差異無統計學意義(P＞0.05);實驗老年組各個時間點與實驗老年組6 h相比，只有實驗組12 h有差異，其余組差異均無統計學意義(P＞0.05)，IL-6在12 h達到最高，之后并逐漸下降;實驗青年組各個時間點與實驗青年組6 h相比，差異均無統計學意義(P＞0.05)，IL-6在12 h達到最高，之后并逐漸下降;實驗組均高于對照組，且差異有統計學意義(P＜0.05，圖9)。

圖8 腦脊液中TNF-α濃度的定量分析Fig.8 Quantitative analysis of TNF-α in cerebrospinal fluid(CSF)

圖9 腦脊液中IL-6濃度的定量分析Fig.9 Quantitative analysis of IL-6 in cerebrospinal fluid

2.8 腦脊液中IL-1β濃度

老年組與青年組相比，老年組IL-1β濃度相對較高，差異均無統計學意義(P＞0.05);實驗組均高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05);對照老年組各個時間點與對照老年組6 h相比，差異無統計學意義(P＞0.05);對照青年組各個時間點與對照青年組6 h相比，差異無統計學意義(P＞0.05);實驗老年組各個時間點與實驗老年組6 h相比，差異均無統計學意義(P＞0.05)，IL-1β在12 h達到最高，之后并逐漸下降;實驗青年組各個時間點與實驗青年組6 h相比，只有實驗組12 h有差異(P＞0.05)，其余組差異均無統計學意義，IL-1β在12 h達到最高，之后并逐漸下降(圖10)。

圖10 腦脊液中IL-1β濃度的定量分析Fig.10 Quantitative analysis of IL-1β in cerebrospinal fluid(CSF)

3 討論

中腦黑質多巴胺神經元進行性選擇性丟失是帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的主要病理特點，涉及氧化應激、異常蛋白、神經毒性作用、凋亡機制和線粒體功能異常等分子和細胞機制［4］。隨著對PD患者和動物模型研究的深入，人們認識到腦內炎性反應可能參與了PD的發病過程。1988年有報道指出，PD患者腦內黑質部位檢測到大量主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)陽性的小膠質細胞［5］，提出炎性反應可能參與PD的發病過程。隨后，更多的研究發現PD患者黑質、紋狀體或腦脊液內各種促炎性因子的水平明顯升高，如1L-1β、IL-6等。

小膠質細胞在正常腦組織發揮重要的免疫監視作用。正常情況下，小膠質細胞處于靜止狀態，其胞體圓且小，突起細長，分支少;輕度激活的小膠質細胞胞體增大變長，突起增粗，分支增多;高度激活的小膠質細胞呈阿米巴樣，胞體更大，突起更粗、更短，甚至消失。小膠質細胞被激活后一方面能夠分泌神經營養因子和抗炎因子如IL-1β等，具有吞噬清除變性死亡神經元的“看家”功能;但其異常激活則表現為損傷效應，釋放前炎性反應因子、活性氧、蛋白酶類和補體蛋白等細胞毒性分子，亦可釋放多種致炎性細胞因子，如誘導型一氧化氮合成酶、TNF-α、IL-1β、T細胞激活相關細胞因子等［6］，從而引起不同程度的免疫炎性反應，導致黑質多巴胺能神經元變性、壞死。多巴胺能神經元對小膠質細胞激活的有害效應具有先天的敏感性。此外，小膠質細胞并不是簡單的“反應性增生”，而是在LPS等刺激因素的作用下在短時間呈爆發式釋放［7］，激發炎性反應，產生大量的神經毒性物質從而啟動多巴胺能神經元的損傷反應。有研究［8-9］發現，中腦黑質區域是大腦中小膠質細胞較為富集的區域，對炎性介導的神經變性過程較為敏感，因此小膠質細胞的激活在帕金森病發生、發展的各個階段中，較之其他神經變性疾病有更為重要的意義。

TNF-α屬于一種前炎性反應因子，具有多效促炎性，在神經變性及脫髓鞘過程中起作用［8-10］。在中樞神經系統內，TNF-α主要由小膠質細胞和星形膠質細胞產生，可以誘導神經元MHC-I表達上調，使之易受到MHC-I限制性細胞毒性T細胞攻擊。本實驗中，TNF-α濃度增加先于免疫組織化學法觀察到的黑質區小膠質細胞激活，進一步證實，當中樞神經系統受損或炎性反應時，甚至中樞神經系統微環境的輕微失衡就能引起小膠質細胞的激活，由靜止狀態變為激活狀態［11-13］。而激活的小膠質細胞可分泌大量的炎性因子，如 TNF-α、IL-6及 IL-1β等，致使神經元變性。有研究［14-15］證實，增生的小膠質細胞可能在某些功能方面存在著不同的亞群，只有特定亞群的小膠質細胞通過TNF-α等參與多巴胺能神經元變性、壞死。

本研究中進一步證實腹腔注射LPS后，可誘導黑質內多巴胺能神經元減少并激活小膠質細胞，多巴胺能神經元的減少隨時間延長而逐漸明顯，活化小膠質細胞的數量在24 h達到高峰，并且黑質內小膠質細胞活化要早于多巴胺能神經元減少，尤其老年組大鼠多巴胺能神經元減少要先于青年組大鼠，減少的程度也比青年組大鼠明顯。老年組大鼠小膠質細胞激活程度比青年組大鼠明顯，雖然老年組活化小膠質細胞數量多于青年組，但是僅在6 h，差異有統計學意義(P＜0.05)。

腹腔注射LPS后，可誘導血漿和腦脊液中TNF-α、IL-6及IL-1β等炎性因子含量增加，血漿中TNF-α、IL-6及IL-1β等炎性因子含量于6 h已出現高峰，并隨時間延長而逐漸減少，而腦脊液中TNF-α、IL-6及IL-1β等炎性因子含量的高峰出現于12 h，比血漿中出現的晚;實驗老年組與實驗青年組比較，在各時間點血漿及腦脊液中TNF-α、IL-6及IL-1β等炎性因子含量差異均無統計學意義(P＞0.05)。

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