腹腔內注射脂多糖對大鼠黑質ROS含量及NADPH酶的影響

白麗娟 姜 新 陳曉虹 任 艷 羅曉光

(1.遼寧省人民醫院神經內科，沈陽110016;2.中國醫科大學附屬第一醫院神經內科，沈陽110001)

小膠質細胞被激活后能夠產生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，產生細胞毒性作用，稱為氧化應激反應。大量研究［1-3］表明，氧化應激在帕金森病的發病機制中起重要作用，而抗炎物質能夠抑制氧化應激反應，具有神經保護作用。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)酶廣泛表達于中胚層來源的細胞中，如小膠質細胞、粒細胞和血管細胞。在外界刺激下，NADPH氧化酶激活，將電子從 NADPH傳遞給氧分子，從而產生ROS。本研究以SD大鼠為研究對象，觀察了經腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)后，大鼠黑質NADPH氧化酶的表達及ROS的產生情況。旨在探討小膠質細胞被激活后的氧化應激機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

取健康SD雄性大鼠，共200只，中國醫科大學動物實驗部門提供，實驗動物許可證號:SCXK(遼)2013-0001。分別將大鼠分為實驗青年組、老年組，對照青年組、老年組4組，各組大鼠均為50只;其中，青年組為雄性兩月齡大鼠(體質量250～350 g)，老年組為雄性12月齡(體質量450～600 g)。

各組又根據不同時間點隨機分為5個亞組，每個亞組分別為10只SD大鼠，分別于給藥后6 h、12 h、24 h、48 h及1周時處死。各組中有25只檢測ROS產生情況，另外25只檢測NADPH酶在胞質蛋白和膜蛋白的表達情況。

1.2 方法

實驗組均給予腹腔注射LPS 1 mg/kg，對照組均給予腹腔注射0.9%(質量分數)氯化鈉注射液1 mg/kg，各組大鼠分別于給藥后 6 h、12 h、24 h、48 h 及 1周時快速斷頭取腦黑質。DCFH-DA探針檢測各組大鼠ROS產生情況。采用Western blotting法檢測各組大鼠NADPH酶情況。

1.3 統計學方法

SPSS 20.0軟件對數據進行析因方差分析，計量數據用均數±標準差(±s)表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 各組大鼠活性氧(ROS)產生情況

老年組與青年組相比，各時間點老年組ROS含量相對較高，但差異無統計學意義(P＞0.05);對照老年組各個時間點與對照老年組6 h相比，差異無統計學意義(P＞0.05);對照青年組各個時間點與對照青年組6 h相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。但實驗老年組、實驗青年組各個時間點與各自實驗老年組、實驗青年組6 h相比，差異均有統計學意義，ROS在12 h達到最高，之后并逐漸下降;實驗組均高于對照組，差異有統計學意義(表1，圖1)。

表1 各組大鼠ROS的量Tab.1 ROS content of the rats in each group n=5

圖1 各組ROS的量Fig.1 ROS content in each group

2.2 檢測各組大鼠NADPH酶表達情況

2.2.1 各組大鼠胞質中NADPH酶表達情況

實驗老年組及實驗青年組在腹腔注射LPS 12 h均可見胞質中NADPH酶表達增多，達高峰，之后隨時間延長而減少;而對照組胞質中NADPH酶表達量隨時間延長無明顯變化(圖2)。

2.2.2 各組大鼠胞膜上NADPH酶表達情況

實驗老年組及實驗青年組在腹腔注射LPS 12 h均可見胞膜上有NADPH少量表達，而對照組未見胞膜上有NADPH酶的表達(圖3)。

圖2 各組胞質中NADPH酶表達情況Fig.2 Expression of NADPH oxidase in cytoplesm

3 討論

機體內產生活性氧的途徑很多，其中包括線粒體呼吸鏈和促氧化酶類。已知激活的小膠質細胞能生成大量的活性自由基(包括活性氧、活性氮)，參與氧化應激反應［4］。NADPH氧化酶是小膠質細胞產生ROS的主要介質，其活性變化對局部組織器官乃至全身活性氧水平的高低具有重要影響。已有研究發現在LPS刺激小膠質細胞活化后，它通過激活NADPH氧化酶產生大量ROS。

NADPH酶廣泛表達于中胚層來源的細胞系中，如小膠質細胞、粒細胞和血管細胞。它由多個亞基組成，包括位于胞膜的b558(gp91phox和p22phox)和胞質亞單位 p47phox、p67phox、p40phox和 GTPase。在外界的刺激下，其胞質中的亞基(主要是p47phox)轉運到細胞膜上，與位于膜上的亞單位 b558結合，NADPH氧化酶激活，催化電子從NADPH傳遞到氧分子，同時產生 ROS［5］。

圖3 各組胞膜上NADPH酶表達情況Fig.3 Expression of NADPH oxidase in membrane

中腦黑質是腦內小膠質細胞密度最高的區域，同時在DA合成過程中會產生大量的對神經元有毒性的易受氧化的DA代謝物，加之多巴胺能神經元的抗氧化能力低，因此，黑質的多巴胺能神經元對氧化應激尤為敏感［6］。研究［7］發現，激活的小膠質細胞中NADPH酶產生的氧化自由基可能是導致DA能神經元變性壞死的“重犯”。已有研究［8］提出PHOX-ROS通路參與了LPS誘導的神經毒性。胞質亞單位p47phox是NADPH氧化酶最重要的調節亞基，它在NADPH酶釋放過氧化物粒子中起關鍵作用［9-12］，p47phox在胞膜上的表達水平是提示PHOX活性的重要指征［13-14］。

本實驗中，腹腔注射LPS 12 h，大鼠黑質內ROS活性達到高峰，但老年組與青年組差異無統計學意義(P＞0.05)，提示LPS刺激后(12 h)無論在老年組與青年組均有小膠質細胞活化，即發生了氧化應激反應。并且，腹腔注射LPS 12 h，老年組及青年組NADPH酶表達均增加，達到高峰，此后逐漸下降，但兩組之間差異無統計學意義(P＞0.05)，而在12 h之后亦可見老年組及青年組NADPH酶由胞質向細胞膜移位，這提示LPS刺激后(12 h)，無論在老年組與青年組氧化應激反應均可能是通過激活NADPH氧化酶途徑而發生的。

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