3xTg-擬AD小鼠腦內(nèi)七種時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析

包訓(xùn)杰 蔡彥寧 祝艷秋 楊翠翠 李 林 張 蘭*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室，北京100053;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京100053;3.神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是一種最常見的癡呆類型和精神障礙。據(jù)估計(jì)我國有600～700萬阿爾茨海默癥患者，60歲及以上人口的癡呆患病率平均為3.5%。全球大約有4 000萬人患有該病，并且患病人數(shù)在未來十年里將呈爆炸式增長［1-2］。AD患者中常出現(xiàn)生理節(jié)律紊亂，據(jù)研究［3-4］報(bào)道，在65歲以上的AD患者中超過80%出現(xiàn)過睡眠障礙、體溫波動(dòng)、激素分泌異常以及糖代謝的異常。這些異常，常常出現(xiàn)在疾病的早期，甚至可以成為AD疾病的預(yù)測(cè)工具或者是AD病理進(jìn)展的診斷靶標(biāo)。因此，研究這種生理紊亂意義重大。

哺乳動(dòng)物的生理節(jié)律中樞位于下丘腦視上交叉核，擁有10 000～15 000個(gè)神經(jīng)元［5-6］，而在一些外周器官，如肝臟、腎臟和心臟等也存在時(shí)鐘節(jié)律調(diào)控點(diǎn)，他們共同控制機(jī)體的節(jié)律表現(xiàn)［7-8］。其除受一些外界影響如光照外，在分子水平主要由一些時(shí)鐘基因調(diào)控，例如 per1、per2、cry1、cry2、bmal1、bmal2、clock 和 npas2等［9］。這些基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后修飾水平相互作用形成了一個(gè)反饋回路，共同影響機(jī)體的整體晝夜節(jié)律［10］。由于基因轉(zhuǎn)錄和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)入核需要一定時(shí)間，生物分子震蕩周期正好維持24 h左右。因此，整個(gè)生理節(jié)律過程可在不同水平、不同時(shí)間點(diǎn)受到影響，而一旦某個(gè)點(diǎn)發(fā)生改變，可能會(huì)引起整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的改變，最終使患者發(fā)生各種各樣的生理紊亂現(xiàn)象。

DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾手段［11］，其可影響基因的表達(dá)水平，通常在多種癌癥的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色［12］。有研究［13］表明CpG島的高度甲基化可影響時(shí)鐘基因的轉(zhuǎn)錄。那么，AD疾病所引起的生理紊亂就有可能是DNA啟動(dòng)子甲基化所引起的。

在本實(shí)驗(yàn)中，筆者采用了3xTg小鼠，通過將APPSwe和tauP301L同時(shí)顯微注射進(jìn)PS1M146V基因敲入小鼠的單細(xì)胞胚胎中，得到的攜帶APPSwe、tauP301L、PS1M146V基因的三重轉(zhuǎn)基因小鼠［14］。3xTg-AD小鼠的神經(jīng)病理學(xué)發(fā)生的區(qū)域-時(shí)程模式十分近似地模擬了AD，而且出現(xiàn)AD的主要病理學(xué)變化——Aβ沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)，同時(shí)伴隨突觸丟失、神經(jīng)元死亡等，并且出現(xiàn)晝夜體溫變化和活動(dòng)規(guī)律異常。

1 材料和方法

1.1 材料

TIANamp Genomic DNA Kit，50 bp DNA Maker(天根生化科技有限公司);Wizard DNA purification resin(Promega，Madison，WI公司，美國);HS Taq 酶(Takara公司，日本);GelGreen(Biotium，CA公司，美國);SssI CpG甲基轉(zhuǎn)移酶(New England Biolab公司，美國)。

1.2 動(dòng)物

3xTg小鼠從美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)，并自行進(jìn)行繁育，每只小鼠均經(jīng)過基因型鑒定，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所SPF級(jí)環(huán)境。動(dòng)物依據(jù)體質(zhì)量進(jìn)行完全隨機(jī)分組。分組方法為:用Excel軟件給每只小鼠隨機(jī)編號(hào)，編號(hào)與每只動(dòng)物體質(zhì)量相對(duì)應(yīng)。對(duì)編號(hào)為1的小鼠產(chǎn)生隨機(jī)號(hào)，并用填充柄拖曳，使所有動(dòng)物均編上不同的隨機(jī)號(hào)，通過復(fù)制和選擇性粘貼對(duì)數(shù)值加以固定。對(duì)產(chǎn)生的隨機(jī)號(hào)進(jìn)行遞增排序，按照隨機(jī)號(hào)從小到大的順序，把動(dòng)物分成實(shí)驗(yàn)所需的組數(shù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為2組，模型組采用3xTg小鼠15只(雄性8只，雌性7只)，14月齡，體質(zhì)量30～40 g。對(duì)照組采用3xTg轉(zhuǎn)基因陰性背景小鼠15只(雄性8只，雌性7只)，14月齡，體質(zhì)量30～40 g。飼養(yǎng)條件:每日光照12 h，黑暗12 h，室溫23℃，任意攝取水食。相同時(shí)間全部處死后，取小鼠新鮮腦組織-80℃凍存待用。實(shí)驗(yàn)全過程對(duì)動(dòng)物的飼養(yǎng)與取材均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)的相關(guān)政策和規(guī)定。

1.3 基因組DNA提取與亞硫酸氫鹽處理

基因組DNA的提取按照TIANamp Genomic DNA Kit說明書進(jìn)行。取小鼠下丘腦組織，加入600 μL裂解液勻漿10 000 r/min離心1 min。本實(shí)驗(yàn)洗脫液TE的量為50 μL，-80℃保存。使用偏重亞硫酸氫鈉和對(duì)苯二酚對(duì)基因組DNA進(jìn)行處理。通過該處理，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。之后用設(shè)計(jì)好的兩對(duì)引物分別擴(kuò)增甲基化與非甲基化的片段。處理過程如下，1 μg基因組DNA使用0.3 mol/L的NaOH進(jìn)行變性。而后使用新鮮配置的偏重亞硫酸氫鈉(終濃度3.0 mmol/L，pH 5.0)與對(duì)苯二酚的混合溶液(終濃度0.5 mmol/L，pH 5.0)與基因組DNA混合，石蠟油覆蓋，避光50℃孵育16 h。之后使用Wizard DNA purification resin純化回收鹽處理過的DNA。

1.4 啟動(dòng)子分析及引物設(shè)計(jì)

時(shí)鐘基因啟動(dòng)子分析應(yīng)用在線軟件(http:∥www.mspprimer.org/cgi-mspprimer/design.cgi)。分析per1、per2、cry2、clock、npas2、bmal1、bmal2 共 7 個(gè)時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上下游各600 bp長度序列。并用該軟件設(shè)計(jì)時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)MSP引物。由于MSP只能檢測(cè)引物3區(qū)大約3～4個(gè)CpG位點(diǎn)，位于引物以外和引物之間的序列不能檢測(cè)到，因此可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。為避免此問題，每個(gè)基因設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，用于擴(kuò)增同一啟動(dòng)子區(qū)不同的位點(diǎn)。MSP引物見表 1，2。

表1 時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化分析第一套引物Tab.1 The first set of primers used for methylation analysis in the promoter of seven clock genes

Mr CGCGAAAAAATAATACTTAACCGCTACG Uf TTGGTTTTTTGGATTATTGAGGTTGGTTATGTTG 115 Ur CTACAACACAAAAAAATAATACTTAACCACTACA Cry2 Mf TTTTCGGTGTATTGGTTTCGTAAAGGATTAC 113 Mr AACCACGAATCGAAAATATAAACGCAACG Uf TGTTTTTGGTGTATTGGTTTTGTAAAGGATTATG 120 Ur CCACAAACCACAAATCAAAAATATAAACACAACA Clock Mf CGTCGGGAGGTAGCGTAATTAC 121 Mr GCACTCACCGAAAACGCG Uf TATGATGTATGTGTTGGGAGGTAGTGTAATTATG 143 Ur CCCAATAAAACACACTCACCAAAAACACA Npas2 Mf CGGAGTTTCGAGATTTCGGC 90 Mr ACCGAAACGACAAACGAACTCG Uf GGTTGTGGAGTTTTGAGATTTTGGTG 105 Ur ACCACAAAAAACCAAAACAACAAACAAACTCA Bmal1 Mf TTTTCGGGCGGGCGTATC 86 Mr CCTTTAAAACCGACAACGAACACG Uf GTGAGTTTTTGGGTGGGTGTATTG 98 Ur CACAAACCCTTTAAAACCAACAACAAACACA Bmal2 Mf TTTTGTTGAGGTTTCGTTCGTGC 163 Mr CCCGACACAATTTCGAAATCTCG Uf GGTTTTGTTGAGGTTTTGTTTGTGTG 176 Ur TATTAAAAACACCCAACACAATTTCAAAATCTCA

表2 時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化分析第二套引物Tab.2 The second set of primers used for methylation analysis in the promoter of seven clock genes

1.5 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)

偏重亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA用HS Taq進(jìn)行擴(kuò)增。M引物的擴(kuò)增子是發(fā)生甲基化改變的序列，U引物的擴(kuò)增子是未發(fā)生甲基化改變的序列。PCR(polymerase chain reaction)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料使用GelGreen。為了確定MSP處理的特異性，SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理的基因組DNA作為陽性對(duì)照，未經(jīng)偏重亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA作為陰性對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3xTg-擬AD小鼠腦內(nèi)時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異條帶的擴(kuò)增

為提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度和可靠性，筆者應(yīng)用兩套引物分別檢測(cè)7個(gè)主要時(shí)鐘基因(per1、per2、cry2、clock、npas2、bmal1和bmal2)啟動(dòng)子區(qū)甲基化。正常小鼠腦內(nèi)，7個(gè)主要時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)呈非甲基化狀態(tài)，3xTg擬AD小鼠腦內(nèi)時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)出現(xiàn)部分甲基化改變。

以clock基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果為例進(jìn)行說明。如圖1所示:M代表甲基化引物擴(kuò)增子，即clock基因CpG島發(fā)生甲基化的片段;U代表非甲基化引物擴(kuò)增子，即clock基因CpG島未發(fā)生甲基化的片段。甲基轉(zhuǎn)移酶(SssI)處理的基因組DNA作為陽性對(duì)照，其甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物(M)出現(xiàn)在121bp位置，非甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)在143bp位置，符合預(yù)期。未經(jīng)鹽處理的基因組DNA作為陰性對(duì)照，兩對(duì)引物均未擴(kuò)增出目的條帶。小鼠腦樣本若出現(xiàn)和甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物一致的條帶，則說明存在甲基化改變;若未出現(xiàn)M擴(kuò)增產(chǎn)物僅擴(kuò)增出U條帶，說明未發(fā)生甲基化改變(圖1)。

2.2 3xTg-擬AD小鼠腦內(nèi)時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的改變

檢測(cè)7個(gè)時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)現(xiàn):cry2基因啟動(dòng)子區(qū)在轉(zhuǎn)基因陰性小鼠腦內(nèi)未出現(xiàn)甲基化，而在3xTg-擬AD小鼠腦內(nèi)甲基化發(fā)生率增高至20%(圖2，表3)。

圖1 Clock基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Methylation analysis of clock promoters

Clock和bmal2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在模型小鼠腦內(nèi)發(fā)生率為6.67%，轉(zhuǎn)基因陰性組未出現(xiàn)甲基化(圖2，表 3)。

Per1、per2、npas2和bmal1基因啟動(dòng)子區(qū)在3xTg-擬AD小鼠和轉(zhuǎn)基因陰性小鼠腦內(nèi)均未出現(xiàn)甲基化改變(表3)。

3 討論

甲基化特異性PCR(MSP)是一種簡單快速和經(jīng)濟(jì)的檢查CpG島甲基化狀態(tài)的方法。由于每對(duì)引物只能檢測(cè)3～4個(gè)甲基化位點(diǎn)，因此容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。為此，除了per1之外，筆者為每個(gè)基因設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，其中一對(duì)針對(duì)甲基化的DNA(M)另一對(duì)針對(duì)非甲基化的DNA(U)，用于擴(kuò)增同一啟動(dòng)子區(qū)不同的位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵步驟——鹽處理過程會(huì)使DNA降解達(dá)90%以上，故初始DNA處理量在1 μg為宜，而小鼠腦組織DNA豐度較低，為實(shí)驗(yàn)帶來一定困難。

現(xiàn)今，AD治療手段匱乏，所有針對(duì)AD的藥物臨床實(shí)驗(yàn)都以失敗告終，而生理節(jié)律的異常不僅可以為AD早期診斷提供線索，而且已有研究［15-17］表明，AD引起的生理節(jié)律紊亂可反過來加重AD的病情，而重置生理時(shí)鐘可以改善患者心理及代謝情況，延長患者生命，這成為治療AD的一個(gè)新的靶點(diǎn)［18］。因此，研究時(shí)鐘網(wǎng)絡(luò)異常的分子機(jī)制就顯得十分重要。Cedernaes等［19］研究發(fā)現(xiàn)正是bmal1、cry1、per1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾引起轉(zhuǎn)錄改變是導(dǎo)致患者急性睡眠障礙的原因。Song等［20］報(bào)道了時(shí)鐘基因翻譯后水平的調(diào)控，他們發(fā)現(xiàn)AD的重要病理Aβ沉積可導(dǎo)致時(shí)鐘網(wǎng)絡(luò)核心蛋白bmal1和cbp的降解。還有一些大樣本量研究［21］中也證實(shí)，同樣存在生理節(jié)律紊亂的帕金森病患者當(dāng)中，npas2基因的甲基化水平明顯低于正常人。

圖2 時(shí)鐘基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Methylation analysis of clock genes using set I primers

在整個(gè)時(shí)鐘基因網(wǎng)絡(luò)中，clock和bmal1(在有的組織是bmal2)起到核心作用，其轉(zhuǎn)錄蛋白clock和baml1可以通過PAS結(jié)構(gòu)域形成異二聚體，結(jié)合到per和cry基因啟動(dòng)子E-boxes［CACGTG］上從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。而當(dāng)per和cry蛋白產(chǎn)生過多又會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核形成聚集體抑制clock-bmal1調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子形成負(fù)反饋環(huán)路［22］。同時(shí)clock-bmal1異二聚體也激活孤兒受體rev-erbα基因轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)蛋白 rev-erbα可與bmal1啟動(dòng)子結(jié)合，阻抑bmal1的轉(zhuǎn)錄，如圖3。clockbmal1異二聚體還可調(diào)控下游的鐘控基因［23-24］如 nampt、alas1等。正因?yàn)閏lock與bmal基因的重要性，其表達(dá)異常甚至能導(dǎo)致時(shí)鐘節(jié)律地缺失［25］。近年來的研究［26］還顯示，cryptochrome(包括 cry1和cry2)的異?；蛉笔?，還可能在機(jī)體的學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙產(chǎn)生中起到作用。

表3 模型小鼠和正常對(duì)照小鼠時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化數(shù)量和頻率Tab.3 Amount and frequency of methylation in the promoters of clock genes in model group and control group

圖3 時(shí)鐘基因網(wǎng)絡(luò)示意圖Fig.3 The network structure of clock genes

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在15例AD模型小鼠中發(fā)現(xiàn)3例cry2基因，1例clock基因和1例bmal2基因啟動(dòng)子CpG區(qū)發(fā)生甲基化，而在15例對(duì)照小鼠中未發(fā)現(xiàn)1例甲基化樣本。雖然模型組與對(duì)照組并未顯示出差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但模型組甲基化頻率高于對(duì)照組，且對(duì)照組甲基化頻率為0。這啟示我們，時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化引起時(shí)鐘蛋白在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致時(shí)鐘網(wǎng)絡(luò)異?？赡苁茿D疾病伴隨的生理節(jié)律紊亂的潛在機(jī)制，但需要更大樣本量研究證實(shí)，這為以后的同類研究提供了一些思路。

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