基于CRISPR/Cas9研究RFX6對斑馬魚胰腺發育的影響

程 呈 吳 謙 盧 晶 仇海燕 李 倩 楊金奎*

(1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科，北京100730;2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京100730;3.北京大學生命科學院，北京100871)

RFX轉錄因子(regulatory factor X-box binding)，是一類翼形螺旋轉錄因子。近年來的研究［1-3］顯示，RFX轉錄因子與某些人類疾病的發生和發展密切相關。在哺乳動物中，RFX基因與保守的順式調節元件X-box的結合在27年前被首次發現［1］。隨后，RFX家族的成員(RFX1～7)在哺乳動物中被陸續發現，其中RFX6可以通過RT-PCR技術在人類和小鼠的胰腺中檢測到，而其他的RFX家族成員則在體內廣泛表達［2］。研究［3］發現，RFX6 純合突變的患者呈現出新生兒糖尿病合并消化系統缺陷的臨床癥狀，包括胰腺發育不全或呈環狀，腸閉鎖或狹窄，腸旋轉不良，膽囊發育不全或缺如等，這些表型被稱之為Mitchell-Riley綜合征。通過對小鼠的RFX6基因進行敲除，研究人員發現RFX6純合小鼠大部分不能正常喂養，由于小腸梗阻而出現腹脹腸鳴，并且在出生2 d后死亡。進一步的研究［2］表明，RFX6純合小鼠除了胰多肽(pancreatic polypeptide，PPY)外，幾乎不能產生所有的胰腺激素。以上研究說明RFX6在胰腺的發育中占據重要地位。

與大鼠、小鼠等哺乳類模式動物相比，斑馬魚體型較小、易于飼養、繁殖周期短(7 d左右)、產卵量大(300～1 000枚)、胚胎透明，使得研究者可以借助先進的成像技術，直接在活體胚胎上觀察器官的發育［4］。為了進一步研究RFX6基因在胰腺中的功能，本研究擬通過基因敲除技術構建RFX6基因敲除的斑馬魚，用于斑馬魚RFX6基因功能的研究。

目前，隨著基因打靶技術的不斷革新，研究者［5-10］已經建立了多個高效并且精確的基因打靶新技術，包括Cre/LoxP〔cyclization recombinztion protein/locus of crossing-over(X)inP1〕系統，鋅指核酸酶(zincfinger nucleases，ZFN)技術和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技術等，并且已經在酵母［5］、線蟲［6］、斑馬魚［7-8］、小鼠［9-10］等物種中成功實現了定點突變。但是，這些新技術也不盡完美，各有優缺點。因此，需要一種成本低、效率高、更為簡便的基因打靶技術。2013年2月，美國加州大學舊金山分校的研究人員在《Cell》［11］上報道了一種高效并且精確的基因打靶新技術——CRISPR/Cas9打靶系統。

本研究運用CRISPR/Cas9打靶技術，設計了針對RFX6的單導向RNA(single guide RNA，sgRNA)，成功誘導了RFX6的靶向突變，并且該突變可以遺傳給下一代。初步篩選后獲得了RFX6基因敲除的斑馬魚，可用于斑馬魚RFX6基因功能的研究，為闡釋斑馬魚胰腺發育機制提供了動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本實驗用AB品系的斑馬魚作為研究材料，在北京大學生命科學院張博教授實驗室培育和繁殖。斑馬魚的養殖條件是28.5℃恒溫魚房，14 h光照/10 h黑暗交替循環，養魚系統保持日夜循環水，每天另補充10%(體積分數)新鮮去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 RFX6基因敲除位點的設計

從斑馬魚基因組網站(http://www.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)得到RFX6基因的序列和結構信息。遵從CRISPR/Cas9介導的斑馬魚基因組定點突變靶點設計原則，對RFX6基因進行靶向設計。

Cas9靶點要求包含20個堿基的主位點，以及緊鄰主位點3’端的PAM區(在20個堿基的主位點之外，由3個堿基構成)。PAM區的序列要求為NGG(N為任意堿基)［12］(圖 1)。

RFX6的主位點序列為:5'-GGAATAATCCAGATGGCCCAGG-3'，用限制性核酸內切酶對擴增后的PCR產物進行酶切，酶切完全，電泳后能明顯與原條帶區分開，證明該Cas9靶點是正確的。篩選出靶點正確的成魚，后續實驗全部選用這批成魚進行。

1.2.2 gRNA的制備

圖1 CRISPR/Cas9作用原理Fig.1 Mechanism of CPISPR/Cas9

1)制備gRNA體外轉錄模板:根據靶點設計合成含有T7啟動子序列的引物序列，即5'-TAATACGACT CACTATA GGAATAATCCAGATGGCCC GTTTTAGA GCTAGAAATAGC-3'(5'下劃線部分為T7啟動子序列，中間加粗部分為Cas9主位點序列，3'下劃線部分為gRNA scaffold序列)。

Tracrrev引物序列，即5'-AAAAAAAGCACCGAC TCGGTGCCAC-3'，用這對引物，以pMD19-gata5_gRNA scaffold(XJW)質粒為模板做PCR，純化PCR產物，即可得到體外轉錄gRNA的模板。

2)體外轉錄gRNA:轉錄體系如表1所示。

表1 轉錄體系Tab.1 Transcription system

按照表1轉錄體系配好20 μL的體系后，放入37 ℃，1 h;然后加入 1 μL TURBO DNase，再次放入37℃，15 min(除去DNA模板);取3μL電泳查看轉錄效果，然后回收gRNA。

3)回收gRNA(用 ambion的 mirVanaTMmiRNA I-solation Kit):用Rnase-free-H2O將gRNA體系稀釋到300 μL，加入330 μL無水乙醇;將上述獲得的混合液加入到回收柱中，1 000 g離心15 s，然后加入700 μL miRNA Wash Solution Ⅰ，離心5 ～10 s，再加入500 μL Wash Solution Ⅱ，離心5 ～10 s，2 次;棄去廢液，1 000 g離心1 min去除殘余的液體，然后加入適量95℃預熱的Rnase-free-H2O，離心30 s即可得到gRNA溶液。

1.2.3 顯微注射

將Cas9mRNA和gRNA混合注射到一細胞期的斑馬魚魚卵中，注射量為Cas9 mRNA 300 pg，gRNA 150 pg;取注射后2～4 dpf的胚胎，提取基因組DNA，PCR，酶切檢測靶點突變效率。

1.2.4 篩選F0

將突變成功的F0胚胎飼養直至性成熟(90 dpf)，與野生型(wild type，WT)成魚交配，收集1 dpf胚胎，4個為1組，針對每一條F0分8組提取基因組DNA，做PCR，反應體系為10 μL體系，正向引物為5'-AAATTCTCAATCTGCCGCCG-3'，反向引物為5'-GGCAGCACAAGCAGGATCTA-3'。PCR反應條件為:95℃ 5 min;95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33 個循環;72℃ 5 min，自然冷卻至室溫，PCR產物酶切，回收未切開的條帶，連接、轉化，TA克隆測序，確定突變類型為3種，分別為:WT:5'-GAAGAAGACCTGGGCCATCTGG-3';+13 bp:5'-GAAGACCTGGG ATTATTAAATAGACCATCTGG-3';+14 bp:5'-GAAGACCTGGG TTATTCCAAGAAGACCATCTGG-3';+22 bp:5'-AAGAAGACCTGGG TTATTCCAAGCCATTAATCCAATAATCTGG-3'。

測序結果如表2所示。將產生上述3種突變的F0斑馬魚與 WT外交，產生大量 F1，篩選 F1(雜合子)。

表2 測序結果Tab.2 Sequencing results

1.2.5 篩選F1

將F1飼養至可以剪尾鰭(大約2個月)，剪尾，提基因組，PCR，酶切(HaeⅢ)，篩選出F1雜合子。帶有同一突變的雜合子可以混合飼養。以篩選出的F1作為親本，建立突變群體。

2 結果

2.1 RFX6基因在斑馬魚胰腺的表達譜

為了研究RFX6基因在斑馬魚胰腺發育過程中的表達情況，采用RT-PCR的方法對多個時間點的斑馬魚胚胎進行分析。結果顯示RFX6基因在斑馬魚發育早期(從5hpf到6 d)持續表達(圖2)，說明RFX6在斑馬魚胚胎胰腺發育中起重要作用。

2.2 RFX6基因缺失對斑馬魚生長發育的影響

通過F1內交可得到F2，在F2的飼養過程中發現10～14 d時，有部分幼魚死亡，收集死亡幼魚尸體，提取基因組，經酶切鑒定大部分為RFX6純合突變體。為了明確這一現象，集中100條幼魚進行常規飼養，在10～14 d時陸續收集到16條死亡幼魚的尸體，經基因鑒定16條中有12條為RFX6純合突變體。這一數據表明，缺失RFX6基因的幼魚在發育早期大部分會死亡。

圖2 RT-PCR擴增RFX6在斑馬魚發育早期的表達Fig.2 Expression of zebrafish in early development after RT-PCR amplification on RFX6RFX:regulatory factor X-box.

繼續飼養F2至可以剪尾鰭，做基因鑒定后發現只有很少的純合突變體可以長至成魚，但身體增長明顯受阻，體型瘦小，呈現糖尿病消瘦體型，其個體尺寸與野生型對照魚的差距明顯(圖3)。其體質量、體長與野生對照組也有明顯差異。RFX6純合突變體發育至性成熟(90dpf)后與WT交配，沒有后代產生。

3 討論

胰腺的發生是一個復雜的過程，需要多種基因參與調控。找到與胰腺發育相關的關鍵基因并利用基因敲除手段研究這些基因的表達與功能，有助于更深入的了解胰腺的發育過程及其中的分子調控機制，這對于研究臨床醫學中內分泌疾病的病理機制，以及制定有效的治療方案乃至開發新藥都有著重大意義。

圖3 斑馬魚體型對比Fig.3 Contrast of zebrafish

隨著大量物種基因組測序的完成，探究關鍵基因的作用和功能變得愈為重要。目前的研究方法主要依賴于基因敲除和轉基因技術，隨著基因敲除技術的日益成熟，一些高效、精確的技術隨之出現，包括Cre/LoxP、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9 等。本研究利用CRISPR/Cas9基因打靶新技術，成功構建了斑馬魚模型，為進一步研究RFX6基因在斑馬魚胰腺發育中的作用提供了有效的研究模型。從本研究結果來看，RFX6基因在斑馬魚發育早期從5 hpf到6 d持續表達，說明RFX6在斑馬魚胚胎胰腺發育中起重要作用。更為重要的是，完全缺失RFX6的斑馬魚在發育早期大量死亡，僅有極個別個體能存活到成年，但是身體增長明顯受阻，體型瘦小，呈現糖尿病消瘦體型。

基于上述研究，本研究還有尚待深入之處。為了研究RFX6在胰腺胚胎發育中的作用，以及解釋純合突變體在發育早期大量死亡和長至成魚的純合突變體呈現消瘦糖尿病體型的原因，下一步工作包括兩個方面:首先，利用原位雜交技術探究胰腺主要表達基因［13-15］，如標記內分泌腺的胰島素(insulin)、胰高血糖素(glucagon)、生長抑素(somatostatin)以及標記外分泌腺的Trypsin等，在RFX6純合突變體中的表達情況;其次，利用RT-PCR技術對這些胰腺表達基因進行半定量分析，利用實時熒光定量PCR技術對這些胰腺表達基因進行定量分析。這兩個方面是后續研究的主要方向。

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