β位淀粉樣前體蛋白裂解酶2基因敲除斑馬魚動物模型的構建及其初步應用

盧 晶 吳 謙 謝榮榮 仇海燕 程 呈 楊金奎*

(1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科 糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京100730;2.北京大學生命科學院，北京100871)

β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(β-site APP-cleaving enzyme 1，BACE1)在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)腦組織中的β-淀粉樣蛋白沉淀中起重要作用［1］。BACE2是BACE1的密切同源物，在阿爾茨海默病的發病中同樣起重要作用。已有研究［2］表明，糖尿病與阿爾茨海默病的發病密切相關。BACE1和BACE2均在人類胰腺組織中高表達，BACE1在胰腺的內分泌和外分泌腺中均有表達，而BACE2僅在胰島β細胞中特異性表達［3］。BACE2在維持胰島β細胞的形態方面具有重要作用。將小鼠BACE2基因敲除后，小鼠的胰島β細胞團增大，空腹血糖下降。葡萄糖刺激后，敲除鼠的胰島素分泌增加，血糖降低明顯［4］。BACE2特異性阻滯劑在小鼠中可刺激新的胰島β細胞生成。BACE2已經成為2型糖尿病的藥物治療新靶點［5］。BACE2在胰島β細胞生成和胰腺發育中的具體作用機制尚不清楚，此外，為尋找糖尿病藥物治療新靶點，針對BACE2基因的大規模藥物篩選亟須建立。

糖尿病動物模型是研究糖尿病發病機制、臨床表現和藥物靶點篩選的基礎。糖尿病動物模型可分為自發性和實驗性糖尿病動物模型兩類。前者與人類的單基因及多基因遺傳的2型糖尿病仍相差甚遠。新近的實驗性糖尿病動物模型包括采用基因敲除技術構建基因修飾動物模型。傳統的基因敲除技術包括胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)細胞打靶技術、鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)技術和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技術［6］。成簇的規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)-Cas9是細菌用來抵御病毒侵襲/躲避哺乳動物免疫反應的基因系統。2013年1月，科學家們利用RNA引導Cas9核酸酶技術可以在多種細胞中特定的基因組位點進行切割、修飾，這一技術隨即被運用到構建基因敲除動物模型中［7-9］。目前這一技術已廣泛用于斑馬魚的敲除動物模型。

斑馬魚的內臟器官、血液與視覺系統，在基因水平上87%與人類同源。斑馬魚具有胚胎透明、體外發育、發育快、后代數量大等優勢，逐漸使其成為遺傳發育研究領域中的一種重要的模式生物［10］。斑馬魚在藥物篩選方面尤其具有極強應用價值。斑馬魚胚胎可以同時提供大量互不干擾的形態學信息，在藥物篩選初期就可評估藥物的毒性，并盡早排除那些能引起毒性的化合物，因此構建疾病基因相關的轉基因斑馬魚可以篩選治療相關疾病的潛在藥物［11］。此外，盡管人和斑馬魚的胰腺形態上存在一定的差別，但是與胰腺發育和疾病相關的分子機制相似。因此，構建斑馬魚動物模型可以觀察特定基因對胰腺發育的影響。

本研究擬應用CRISPR/Cas9技術構建BACE2大片段刪除的斑馬魚模式動物模型。該動物模型將被用于斑馬魚BACE2基因對胰腺發育的功能研究，為闡釋斑馬魚胰腺發育機制提供了動物模型。本課題組將在后續研究中進一步運用BACE2斑馬魚模式動物模型進行大規模藥物篩選，篩選出針對糖尿病的新型藥物。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究在北京大學生命科學院張博教授斑馬魚飼養中心培育斑馬魚。選用AB品系的斑馬魚作為研究對象。斑馬魚的養殖條件是28.5℃的恒溫魚房，14 h光照/10 h黑暗交替循環，飼養環境保持日夜循環水，每天另補充10%新鮮去離子水。

pMD 19-gRNA scaffold質粒由北京大學熊敬維教授饋贈。MirVanaTMmiRNA isolation kit(Ambion公司，美國);動物組織總RNA提取試劑盒(貨號DP431)，Fast Quant cDNA第一鏈合成預混試劑(貨號KR108)均購自天根生化科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 設計BACE2基因敲除靶點

本實驗從斑馬魚基因組網站(http://www.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)得到斑馬魚BACE2基因的序列和結構信息。根據CRISPR/Cas9介導的斑馬魚基因組定點突變靶點設計原則，對BACE2基因進行靶向設計。Cas9基因打靶系統由Cas9核酸酶和guide RNA(gRNA)構成，其中gRNA中含有主位點序列，負責識別靶基因;Cas9核酸酶負責切割靶點，造成DNA雙鏈斷裂(double strand break，DSB)。Cas9靶點要求包含20個堿基的主位點和緊鄰主位點3’端的PAM區。PAM區的序列要求為NGG，N為任意堿基。

本研究采用大片段刪除的突變(deletion)的方法，因此需要同時設計兩個位點。刪除長度應控制在0.5～3 Kb之間，兩個靶點的效率應分別在30%和50%以上。根據這一原則，最終選擇BACE2的兩個靶點序列分別為:上游靶位點序列5'-GGTTGAGTAGCATGTGATGCAGG-3';下游靶位點序列為5'-GGTGTGCTATGTTGGAGATGGG-3'。

1.2.2 gRNA的制備

1)制備gRNA體外轉錄模板

根據BACE2靶點設計、合成含有SP6啟動子序列的引物序列。上游的引物序列為:5'-ATTTAGGTGACACTATA GGTTGAGTAGCATGTGATGC GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'。下游的引物序列為5'-ATTTAGGTGACACTATA GGTGTGCTATGTTGGAGAT GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'(5'下劃線加粗部分為SP6啟動子序列，中間畫框為Cas9主位點序列，3'下劃線部分為gRNA scaffold固定序列)。

合成Tracr rev引物，序列為5'-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3'。使用 SP6引物和 Tracr rev引物對，以pMD19-gRNA scaffold質粒(質粒圖譜詳見圖1)為模板，采用PCR擴增得到體外轉錄gRNA模板。PCR產物采用DNA產物超薄純化試劑盒(天根生化科技有限公司，貨號DP203)回收。

2)體外轉錄和回收gRNA

按照gRNA體外轉錄體系配置方法，體外轉錄gRNA。體外轉錄體系(20 μL)如下:SP6 Enzyme 2 μL，5×TransBuffer 2 μL，100 mmol/L DTT 2 μL，RNasin 0.5 μL，NTP(10 mmol/L)2 μL，DNA 模板1 μg，補足DEPC H2O至20 μL。37℃ 體外轉錄1 h，加入1 μL TURBO DNase，再次放入37 ℃，15 min;取3 μL 電泳查看轉錄效果，采用mirVanaTMmiRNA isolation kit回收gRNA。

圖1 pMD19-gRNA scaffold質粒載體示意圖Fig.1 pMD19-gRNA scaffold plasmid vectors

1.2.3 制備F0斑馬魚和靶點突變效率篩選

將Cas9 mRNA和gRNA混合注射到一細胞期的斑馬魚魚卵中，注射量為:Cas9 mRNA 300 pg，gRNA 150 pg;取注射后受精后2～4 d(2～4 days post fertilization，2～4 dpf)的斑馬魚胚胎，提取基因組DNA，進行PCR。PCR上游引物為5'-TGTTCCGCGGATGCATTAAG-3';下游引物為5'-TACCACACGACACCCAATGC-3'。反應條件為:95℃ 5 min;95℃ 30 s，59℃ 30 s，72 ℃ 60 s，33 cycles;72 ℃ 5 min，自然冷卻至室溫。將Deletion的條帶回收、連接、轉化，構建到pGEM-T-easy載體后測序。

將突變成功的F0胚胎飼養直至性成熟(90 dpf)，與野生型(wild type，WT)成魚交配，收集1 dpf胚胎，4個為一組，針對每一條F0分組提取基因組DNA，進行PCR。

1.2.4 篩選BACE2基因刪除的F1成魚

將含有BACE2基因大片段刪除的F0斑馬魚與WT交配，產生大量F1，至少需要60條成魚，篩選F1(雜合子)。將F1飼養至兩個月左右剪尾鰭，提基因組，進行PCR，PCR反應條件同1.2.3。將Deletion的條帶回收、連接、轉化，構建到pGEM-T-easy載體后測序確定基因型。帶有同一突變的雜合子的魚可以混合飼養。以篩選出的F1作為親本，建立突變群體。

1.2.5 RT-PCR檢測不同時間BACE2表達

為了研究BACE2基因在斑馬魚胰腺發育過程中的表達情況，本研究采用RT-PCR的方法對不同時間點的斑馬魚胚胎進行分析。采用動物組織總RNA提取試劑盒提取成魚的RNA，采用FastQuant cDNA第一鏈合成預混試劑合成cDNA。β-actin基因作為內參。采用DragonPCR儀器檢測BACE2基因在不同時間的斑馬魚胚胎中的表達情況。β-actin基因上游引物:5'-TGTTTTCCCCTCCATTGTTGG-3';下游引物:5'-TTCTCCTTGATGTCACGGAC-3'。BACE2基因上游引物:5'-TATTTGCGGGGAAATTCAAC-3';下游引物:5'-TGATGTAGGGATGTGCTGCT-3'。PCR反應體系為20 μL，2×Enzyme mix 10 μL;正向引物 0.4 μL;反向引物0.4 μL;cDNA 1.5 μL，DEPC H2O 7.7 μL。擴增條件為94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35 cycles;72℃ 5 min，自然冷卻至室溫。

2 結果

2.1 成功構建BACE2大片段刪除的F0斑馬魚

將Cas9 mRNA和gRNA混合注射到一細胞期的斑馬魚魚卵中，取注射后2～4 dpf的斑馬魚胚胎，提取基因組DNA，進行PCR。PCR結果見圖2。結果顯示，WT為一條帶，大小為1 025 bp，含有BACE2基因刪除的斑馬魚除了WT條帶，還有一條477 bp的條帶。將477 bp條帶切膠回收構建到pGEM-T-easy載體，測序結果顯示該條帶為BACE2基因刪除548 bp后的序列(圖3，測序圖為反向互補序列)。

圖2 PCR擴增BACE2刪除序列附近PCR產物Fig.2 PCR amplification of BACE2，delete PCR product near the sequence

圖3 BACE2基因刪除548bp測序圖及序列示意圖Fig.3 Sequencing graph of BACE2 gene after deleting 548 bp using reversed complementary sequence

2.2 BACE2基因缺失對斑馬魚生長發育的影響

本研究將篩選后得到的BACE2基因大片段刪除F1經內交后得到F2代斑馬魚。F2代斑馬魚繼續飼養至12～16 d時，有部分幼魚死亡。收集死亡幼魚尸體，提取基因組，經 PCR檢測鑒定死魚大部分為BACE2純合突變體。為深入研究這一現象，本研究收集100條幼魚進行常規飼養，飼養至12～16 d時共收集到24條死亡幼魚的尸體，經PCR擴增后鑒定結果顯示，24條死魚中有14條為BACE2純合突變體。這一數據表明，缺失BACE2基因的幼魚在發育早期部分無法存活。

本研究繼續飼養F2斑馬魚至其成熟后剪尾鰭，做PCR檢測鑒定其基因型發現只有極少的純合突變體可以長至成魚。BACE2純合突變斑馬魚的體質量、體長與野生對照組無明顯差異。

2.3 BACE2基因在斑馬魚胰腺的表達譜

為研究BACE2基因在斑馬魚胰腺發育過程中的表達情況，本實驗采用RT-PCR對不同時間點的斑馬魚胚胎的BACE2基因表達進行檢測。選用β-actin作為內參。結果顯示BACE2基因在斑馬魚發育早期(從受精后18 h到3 d)持續表達，這說明BACE2基因在斑馬魚胚胎胰腺發育中起重要作用。詳見圖4。

圖4 RT-PCR擴增BACE2在斑馬魚發育早期的表達Fig.4 Expression of RT-PCR amplification of BACE2 in the early development of zebrafish

3 討論

本研究利用CRISPR/Cas9基因打靶技術，成功構建了BACE2基因大片段刪除的斑馬魚動物模型。篩選F1代成魚后結果顯示，BACE2純合突變體在發育早期部分死亡，僅有部分能存活至成魚。通過RTPCR檢測發現，BACE2基因在斑馬魚發育早期從5 hpf到6 d持續表達，這說明說明BACE2在斑馬魚胚胎的胰腺發育中起重要作用。

本研究采用新型的基因敲除技術，即CRISPR/Cas9基因打靶技術。這一技術具有以下幾點優勢。首先，CRISPR/Cas9基因打靶技術無物種限制，可以用于小鼠［12-13］、大鼠、酵母［14］、線蟲、斑馬魚［15］等多種生物。其次，與其他基因敲除技術，如傳統的ES細胞打靶技術、鋅指核酸酶技術和TALEN相比，CRISPR/Cas9敲除技術具有時間周期短的優點。傳統的ES細胞打靶技術周期約為12個月，采用TALEN技術構建基因敲除動物模型周期約為9個月，而CRISPR/Cas9敲除技術僅需要6個月即可得到F1代基因敲除斑馬魚。第三，與鋅指核酸酶技術和TALEN技術相比，CRISPR/Cas9技術具有敲除效率更高，脫靶率更低的優點。第四，CRISPR/Cas9基因打靶技術操作簡單，需要的儀器較少。根據靶點選擇原則設計合適的CRISPR/Cas9靶點，構建gRNA后與Cas9共同注射斑馬魚卵，檢測敲除效率即可。本研究利用最新的CRISPR/Cas9基因打靶技術，3個月內即成功構建了BACE2基因大片段刪除的斑馬魚動物模型。

本研究的后續工作將圍繞胰島發育機制和藥物篩選兩方面進行。首先，本課題組將檢測BACE2雜合或純合突變體和WT斑馬魚的血糖和胰島素分泌情況。為進一步研究BACE2基因在斑馬魚胰腺發育中的作用機制，本課題組將利用原位雜交技術和實時熒光定量PCR技術探究胰腺主要表達基因，如標記內分泌腺的胰島素、胰高血糖素、生長抑素以及標記外分泌腺的胰蛋白酶等，在BACE2雜合或純合突變體中的表達情況。此外，運用斑馬魚作為整體動物模型進行高通量的篩選并跟蹤考察藥物在斑馬魚模型體內的吸收、代謝及分布等情況，將為糖尿病研究提供更多的具有臨床應用價值的有效信息。本課題組將運用本研究構建的BACE2敲除斑馬魚動物模型進行糖尿病的藥物篩選，尋找糖尿病的藥物治療新靶點。

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