Cu2+對青蛤的脅迫效應

梁 健, 雷雅雲, 李永仁, 郭永軍, 邢克智

(天津農學院 水產學院, 天津市水產生態及養殖重點實驗室, 天津 300384)

青蛤(Cyclina sinensis)屬簾蛤目、簾蛤科、環文蛤屬。主要分布于朝鮮半島、中國大陸、臺灣海區, 常棲息在近高潮區和中潮區的泥沙灘中[1-2]。青蛤生長速度快, 適應能力強, 分布廣泛, 種群密度大, 是重要的經濟貝類。另外, 由于青蛤成體移動性差, 活動范圍較小, 且為濾食性, 易蓄積環境中的重金屬離子, 造成自身損害[2]。近年隨沿海經濟的飛速發展,工業和生活污水的排放量增大, 近岸海域重金屬污染日趨嚴重。有關重金屬對灘涂貝類的毒性、免疫指標的報道很多, 如 Cd2+[3]、Pb2+[4]、Hg2+[5]、Zn2+[6]、Cu2+[7]等。但對于銅離子在青蛤體內不同組織的蓄積及對免疫機能的影響尚未見報道。銅作為一種生物體必須元素, 在自然界中少量的存在不會直接威脅到生物體的生存, 但會通過食物鏈的蓄積作用間接威脅到末端生物的健康。本研究在測定 Cu2+對青蛤的半致死濃度和安全濃度基礎上, 觀察在不同濃度Cu2+的脅迫下青蛤各組織中蓄積情況及血淋巴液中免疫指標的變化趨勢, 探索青蛤的應激反應機制,以期為青蛤健康養殖奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

青蛤取自天津獨流減河河口, 個體健康、大小相似, 平均殼長35.32 mm±0.89 mm。在室內暫養5 d,養殖用水為砂濾海水, 鹽度25, 溫度25～28℃, 暫養期間連續充氧, 每天全量換水1次, 投喂小球藻。暫養后選擇閉殼能力強、反應迅速的個體作為試驗用貝。

1.2 Cu2+對青蛤的急性毒性實驗

根據預實驗結果, 參照周永欣等[8]的等對數間距法設置Cu2+離子6個濃度, 分別為0.03、0.06、0.13、0.25、0.50和1.00 mg/L, 及空白對照, 試驗設3個平行。每組飼養青蛤10枚, 實驗期間不投餌、不充氣,每天半量換水1次, 及時挑出死亡個體。實驗開始后24、48、72、96 h統計各組青蛤死亡數。貝殼張開, 外套膜收縮, 用玻璃棒輕輕觸碰長時間未反應的個體視為死亡。

1.3 青蛤對Cu2+的蓄積實驗

1.3.1 實驗設計

將健康青蛤暴露在 Cu2+的半致死濃度和安全濃度兩種濃度(由前面實驗所得出)的養殖環境中, 設 3個平行, 每組150個個體。實驗期間不投餌、不充氣,每天半量換水1次, 及時挑出死亡個體。實驗開始后6、12、36、72、96、120和168 h, 各實驗組解剖青蛤5個, 分離鰓和內臟團并稱重記錄。

1.3.2 Cu2+含量測定

消化試管加入樣品和消化液(硝酸和高氯酸 4∶1), 加熱消化至液體澄清, 用 1%的硝酸定容。利用天津農學院農業分析測試中心提供的原子吸收分光光度計測定Cu2+濃度。

1.4 免疫指標測定

在蓄積實驗中, 分別在 6、12、24、36、48、72、96、120、144、168 h時間點取樣, 并設自然海水為對照。每組隨機選取5枚青蛤, 從圍心腔抽取血淋巴液并混合。在6 000 r/min、4℃下離心10 min, 取上清液, 使用南京建成生物工程公司提供的試劑盒測定超氧物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)的活性及總蛋白的含量。

1.5 數據處理

用SPSS17.0軟件對實驗數據進行線性回歸分析,計算半致死濃度、95%置信區間和相關系數R。并用T-test對實驗數據進行進行顯著性檢驗(P<0.05)。

安全濃度的計算參照公式[9]:

安全濃度(SC)=96h LC50×AF

其中: AF為應用系數, 設為0.01。

2 結果

2.1 Cu2+對青蛤的急性毒性

通過線性回歸統計分析, 得到死亡率概率單位與Cu2+濃度對數的相關方程為y=0.146+1.568x, 相關系數R2=0.897。半致死濃度LC50=0.807 mg/L, 95%置信區間為0.548～1.533 mg/L, 安全濃度為0.008 07 mg/L。

2.2 青蛤對Cu2+的蓄積

半致死濃度脅迫下, 青蛤外殼緊閉, 活動逐漸減少。由表2可知, Cu2+在青蛤鰓和內臟團的含量隨時間延長而升高, 在鰓中 72～120 h增長迅速, 隨后變得平穩, 在 168 h達 8.95μg/g, 平均蓄積速度0.053μg/(g·h)。Cu2+在內臟團中蓄積緩慢, 168 h 達到6.28μg/g, 平均蓄積速度為 0.037μg/(g·h)。整個過程中, 鰓中的Cu2+含量始終高于內臟團。

表1 不同濃度Cu2+對青蛤的急性毒性Tab.1 Mortality of C. sinensis exposed to different concentrations of Cu2+

表2 半致死濃度(0.807 mg/L)脅迫下青蛤各組織內Cu2+含量Tab. 2 Cu2+ contents in different tissues of C. sinensis at LC50 (0.807 mg/L)

由表3可知, 安全濃度下, 6 h時鰓和內臟團Cu2+的含量分別為3.8μg/g和2.01μg/g, 且在12 h內增加明顯, 隨后隨處理時間延長緩慢升高。在鰓中的平均蓄積速度為0.033μg/(g·h), 內臟團中平均蓄積速度為0.014μg/(g·h), 鰓組織中Cu2+的含量始終高于內臟團。

表3 安全濃度脅迫(0.008 07 mg/L)下青蛤各組織內Cu2+含量Tab. 3 Cu2+ contents in different tissues of C. sinensis at the safe concentration (0.00 807 mg/L)

2.3 Cu2+對青蛤生化指標的影響

由圖1可知, 兩實驗組SOD活性均高于對照組,半致死濃度處理組從6 h起SOD活性與對照組差異顯著(P<0.05), 且逐漸增加, 并于 24 h時達峰值81.55 U/mg; 隨后SOD活性下降, 在144 h時與對照組差異不顯著(P>0.05); 該處理組全程 SOD活性變化呈“誘導-抑制”趨勢。安全濃度處理組SOD活性穩定, 且顯著高于對照組(P<0.05)。

圖1 不同濃度下Cu2+的青蛤血淋巴SOD活性比較Fig.1 Comparison of the SOD activity of haemolymph in C.sinensis with different concentrations of Cu2+

圖2可知, 在36～72 h, 處理組CAT活性顯著高于對照組(P<0.05)。半致死濃度處理組在12～48 h內CAT活性增長緩慢, 在72 h達峰值12.35 U/mg, 在96～168 h階段, 與對照組差異不顯著。安全濃度處理組在6～48 h內變化不大, 在72 h達峰值12.26 U/mg。表現出“誘導-抑制-誘導”趨勢。

圖2 不同濃度下Cu2+的青蛤血淋巴CAT活性比較Fig.2 Comparison of the CAT activity of haemolymph in C.sinensis with different concentrations of Cu2+

圖3可知, 6～72 h階段, 處理組ACP活性與對照組差異顯著(P<0.05), 且半致死濃度處理組誘導效應更為明顯, 在24 h時出現峰值3.25 U/mg; 安全濃度處理組ACP活性保持穩定, 且高于對照組。

圖3 不同濃度下Cu2+的青蛤血淋巴ACP活性比較Fig.3 Comparison of the ACP activity of haemolymph in C.sinensis with different concentrations of Cu2+

3 討論

3.1 Cu2+在青蛤體內的蓄積

本研究中得到的Cu2+對青蛤的96 h半致死濃度LC50=0.807 mg/L, 安全濃度為0.008 07 mg/L, 張麗巖等[3]研究中指出 Cd2+對青蛤的半致死濃度為LC50=20.09 mg/L, 安全濃度為 0.201 mg/L, 這個數值是Cu2+的近24倍, 說明青蛤對于Cu2+的耐受性遠遠低于Cd2+。

在半致死濃度和安全濃度脅迫下, 青蛤對 Cu2+的蓄積能力順序為鰓>內臟團, 這可能與貝類自身生理特性有關。重金屬在貝類組織內的蓄積通常有以下幾種方式: 一是在呼吸過程中由表皮滲透入鰓組織中, 通過血液循環被輸送到其他組織器官; 二是在攝食消化過程中間接地被貝類所攝入。鰓作為呼吸器官直接接觸到環境中的 Cu2+, 而在試驗過程中不投喂餌料, 降低內臟團通過食物對 Cu2+的蓄積量,導致鰓對 Cu2+的蓄積能力大于內臟團。體表與水體的滲透交換作用是重金屬進入貝類體內的一個重要途徑[10], 主要有以下的兩種模型: 高親和力的重金屬和蛋白結合后被水生生物攝入體內; 重金屬離子通過活性泵作用運輸到水生生物體內。這導致試驗期間未投喂餌料而內臟團具有對Cu2+的蓄積作用。

本試驗中所得出的 Cu2+安全濃度(0.008 07 mg/L),未超出國家農業部發布的《無公害食品標準——淡水海水養殖水質》中所要求的0.01 mg/L[11], 而張麗巖等[13]研究 Cd2+對青蛤的安全濃度為 0.201 mg/L, 高于國家標準(0.005 mg/L)40倍。

3.2 Cu2+對青蛤抗氧化酶活性的影響

貝類的免疫主要是其血淋巴液中的細胞免疫和體液免疫, 其中, 血細胞是貝類執行細胞免疫的主要功能因子, 是無脊椎動物免疫系統的首道防線,外界環境的變化會對血細胞的免疫能力產生巨大影響[12]。

一些研究表明, 當貝類受到污染脅迫時, 能夠通過呼吸爆發作用產生大量活性氧, 用以幫助機體清除進入體內的病原, 但過量的活性氧會導致生物體體內細胞膜的脂質化程度加快, 造成損傷, 此時,生物體會自動激活體內的抗氧化系統, 以避免活性氧對自身細胞的傷害[13-14]。丁鑒峰等[15]發現, 隨著不同地區的污染程度加重SOD活性逐漸升高, 但當污染程度達到一定時, SOD活性會急劇下降, 生物體內出現大量氧自由基, 損傷機體。陳林林等[5]的研究結果表明, 重金屬能夠在短期內增加紫貽貝抗氧化酶的活性, 但隨著脅迫時間的延長, 便會抑制相關抗氧化酶的活性。在本研究中, 半致死濃度(0.807 mg/L)脅迫下青蛤血淋巴液中SOD和CAT的活性均出現了先誘導再抑制的趨勢, 這一現象與上述的研究結論相一致。在脅迫初期, 體內迅速產生活性氧, 激活其抗氧化能力, 體內SOD和CAT活性上升, 以保證其細胞膜的脂質氧化程度最低。隨著時間的延長, 過多的活性氧便會抑制SOD和 CAT的產生和活性, 便會出現試驗后期SOD活性降低的趨勢。貝類在長時間重金屬脅迫下, SOD、CAT活性則在一段時間后出現大幅度的降低, 表明高濃度金屬離子脅迫下抗氧化酶的活性抑制。

而在安全濃度(0.008 07 mg/L)下, 處理組表現出SOD、CAT活性水平高于對照組, 但誘導趨勢不及半致死濃度處理組顯著。說明 Cu2+脅迫對 SOD、CAT活性的誘導與濃度相關, 在較低濃度時, 誘導效應和抑制效應較弱, 隨濃度增加, 誘導效應加強, 達峰值后, 抑制效應也表現顯著。

3.3 Cu2+對青蛤水解酶活性的影響

磷酸水解酶(ACP), 簡稱磷酸酶, 是一類酸性水解酶, 存在于貝類血細胞溶酶體中, 當外來異物進入體內或環境發生變化時, 變可以通過胞內和胞外途徑, 催化有機磷酸水解, 釋放磷酸根離子, 參與對異物以及病原的殺傷和清除[15]。本研究中, 半致死濃度脅迫下青蛤血淋巴液中ACP活性呈現出先升高后抑制的趨勢, 脅迫初期產生誘導現象的原因可能與抗氧化酶機制一致; 脅迫后期ACP活性的降低可能通過以下兩條途徑所導致: 一是由于污染物造成的貝類血細胞溶解, 導致含有 ACP的溶酶體失活; 二是污染物可能改變血細胞內溶酶體的膜通透性, 導致ACP滲漏[16]。

綜上所述, 青蛤養殖環境中的重金屬 Cu2+能夠產生蓄積作用, 且鰓的蓄積能力要遠遠強于內臟團;Cu2+對青蛤的安全濃度并未超過國標中海水淡水養殖水質標準的規定; 高濃度 Cu2+能夠誘導青蛤產生免疫抑制并導致其抗病能力下降, 加之其他污染物的影響可能是導致夏季青蛤大規模死亡的重要誘因。因此維護養殖環境, 減少重金屬的排放, 是防止青蛤爆發性死亡的有效途徑。

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