基于Illumina HiseqTM 2000高通量轉(zhuǎn)錄組測序的里氏擬石磺SSR標(biāo)記開發(fā)

吳 欣, 沈和定, 王冬鳳, 劉 宸, 楊鐵柱, 刁 亞

(上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室, 上海 201306)

石磺是軟體動物門(Mollusca) 、腹足綱(Gastropoda) 、肺螺亞綱(Pulmonata)、石磺總科(Onchidioidea) 、石磺科(Onchidiidae)的一群貝類, 主要分布于熱帶或亞熱帶地區(qū)的海岸、灘涂、巖礁、紅樹林、潮間帶地區(qū), 是海洋與陸地的過渡帶生物[1-2]。我國的石磺主要分布在東南沿海的潮間帶高潮區(qū), 已報道易采集的主要有4種, 包括瘤背石磺(Onchidium struma)、平疣桑葚石磺(Platevindex mortoni)、紫色疣石磺(Peronia verruculata)、里氏擬石磺(Paraoncidium reevesii), 學(xué)者對于石磺的研究主要集中在瘤背石磺,對后3種研究報道較少。其中, 里氏擬石磺的研究主要集中在形態(tài)學(xué)[1-3]、化學(xué)成分測定[4-6]、線粒體基因組及群體多樣性的分析[7-9]幾個方面, 未見利用分子標(biāo)記研究其遺傳多樣性的報道。

微衛(wèi)星, 又稱簡單重復(fù)序列(SSR)[10], 具有高穩(wěn)定性、高多態(tài)性、引物通用性、位點特異性、檢測方便和呈共顯性遺傳等特點, 在水產(chǎn)動物中主要用于遺傳連鎖圖譜的制備、性狀分析、QTL 定位、群體遺傳學(xué)、進化遺傳、種質(zhì)鑒定與親權(quán)分析, 品種培育等方面[11]。里氏擬石磺作為海洋向陸地進化的過渡物種之一, 在研究海洋無脊椎動物向陸地輻射進化中具有重要作用[12-13], 本研究利用 Illumina HiseqTM 2000高通量轉(zhuǎn)錄組測序?qū)锸蠑M石磺進行微衛(wèi)星(SSR)分子標(biāo)記開發(fā), 為研究其群體遺傳學(xué)和石磺科不同種貝類間的系統(tǒng)發(fā)生提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗材料于2015年5月采自廣東湛江海灘, 共37個, 樣本經(jīng)鑒定后均保存于 95%無水乙醇并置于–20℃冰箱中備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 里氏擬石磺轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

隨機挑選6只于2012年10月采自湛江的里氏擬石磺個體進行活體解剖, 將解剖得到的不同組織保存于RNA later(Qiagen: 76104)中用于構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測序文庫并送晶能公司(Genergy Biotechnology)進行Illumina HiseqTM 2000雙末端測序及生物信息學(xué)分析, 共獲得原始數(shù)據(jù)9.161 GB, 有效數(shù)據(jù)8.617 GB。通過de novo拼接獲得了長度大于100 bp的轉(zhuǎn)錄物233 636條; Unigene N50長度485 bp, 經(jīng)GO注釋分析有 124 598(53.33%)條歸入生物學(xué)過程, 51 891(22.21%)條歸入分子功能, 57 136(24.46%)條歸入細(xì)胞組分, 對大于200 bp的拼接序列與Nr數(shù)據(jù)庫進行比對, 22 558條序列得到蛋白注釋, 匹配蛋白數(shù)目為2 910個, 對注釋后的數(shù)據(jù)進行分析, 共涉及物質(zhì)及能量代謝、信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及免疫應(yīng)答等諸多生理生化過程。

1.2.2 微衛(wèi)星序列的來源

根據(jù)晶能公司(Genergy Biotechnology)基于Illumina HiseqTM 2000測序平臺所得的拼接序列,經(jīng) MISA(http: //pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對微衛(wèi)星位點進行分析, 對于非混合型位點篩選時, 設(shè)置條件為單堿基重復(fù)至少10次, 2堿基重復(fù)至少6次,3～6堿基重復(fù)至少5次, 在此基礎(chǔ)上, 如同一序列中兩個SSR位點間離小于50 bp, 則認(rèn)為這兩個SSR位點組成一個混合型 SSR位點, 在設(shè)計引物前利用SSR Hunter1.3[14]對經(jīng)MISA篩選過的含有微衛(wèi)星位點的序列進行再次篩選, 保證序列的前后側(cè)翼有足夠的長度用于設(shè)計引物, 篩選條件和第一次一樣,最終篩選出51條含有微衛(wèi)星位點并適合設(shè)計引物的序列。

1.2.3 SSR引物設(shè)計與合成

利用Primer Premier 5.0(http: //www.premierbio soft.com/)軟件對上一步所得的51條拼接序列進行引物設(shè)計, 引物長度為19～26 bp, GC含量在40%～60%之間, 也可放寬至30%～70%, 引物Tm值小于72℃,且上下游引物Tm值差別不能大于2℃, 擴增引物長度在100～300 bp, 所設(shè)計引物在側(cè)翼保守序列內(nèi)。本實驗共設(shè)計51對引物, 所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.4 樣品DNA的提取

取出之前保存于–20℃冰箱樣品, 根據(jù)天根生化科技(北京)有限公司的海洋動物基因組提取試劑盒(DP324)的要求, 在每只樣品腹足處各取 30mg組織塊用于DNA提取, 提取后的DNA置于–20℃冰箱暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)體系為10μL, 包括上下游引物各0.3 μL,2×Taq PCR Master Mix 5μL, ddH2O 4μL, DNA 模板0.4 μL。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃ 30 s,退火30 s, 72℃ 30 s, 共40個循環(huán); 72°C延伸10 min。產(chǎn)物保存于4℃。引物初篩PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, God view染色, 電泳條件為: 115 V,35 min, 電泳緩沖液為1×TAE, 凝膠成像系統(tǒng)拍照。引物進行群體檢測時, PCR擴增產(chǎn)產(chǎn)物8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離, 電泳條件為: 電壓 110 V,電泳時間6 h, 電泳緩沖液為1×TBE; 電泳結(jié)束后用硝酸銀對凝膠染色并使用相機進行拍照。

1.2.6 里氏擬石磺SSR引物的篩選及群體檢測

隨機選取5個里氏擬石磺個體, 提取其DNA并將其混合作為引物特異性和最適退火溫度篩選時的模板DNA, 根據(jù)每對引物的Tm值設(shè)置間隔為1.5℃的溫度梯度, 共設(shè)置 8個溫度梯度, 用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測, 將擴增清晰, 條帶單一的引物留用, 確定每對引物的最適退火溫度, 以便進行后續(xù)檢測。

選取 32個湛江群體的里氏擬石磺個體, 提取DNA作為模板, 使用初篩后留用的引物進行PCR擴增, PCR反應(yīng)條件及產(chǎn)物檢測方法遵照上述方法, 并對產(chǎn)物進行拍照留存。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

對湛江群體里氏擬石磺的 PCR擴增結(jié)果進行統(tǒng)計時, 將每個位點的擴增條帶按從小到大的順序標(biāo)記為A, B, C…, 并統(tǒng)計出每個位點在進行群體檢測時的基因型, 使用 Cervus3.0[15]軟件計算每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)(number of allele,Na), 觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho), 期望雜合度(expected heterozygosity,He), 多態(tài)性信息含量(polymorphic information content, PIC), 使用Genepop4.2[16]進行每個位點的 Hardy–Weinberg平衡的檢測。

2 結(jié)果分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組中SSR位點的軟件分析結(jié)果

利用 MISA軟件在里氏擬石磺轉(zhuǎn)錄組中查找SSR位點的結(jié)果, 如表1所示。

2.2 里氏擬石磺SSR篩選結(jié)果

51對引物在經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳的初篩之后有24對擴增出清晰單一的條帶, 擴增率為 47%。將這24對引物在湛江群體32個個體中做進一步的聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選, 有 14個位點表現(xiàn)為多態(tài)性, 其余位點表現(xiàn)為單態(tài)性。在表現(xiàn)出多態(tài)性的14個位點中, 7個位點的等位基因為4, 4個位點的等位基因為3, 3個位點表現(xiàn)為2等位基因。14個位點中, 1個位點為五堿基重復(fù), 2個位點為四堿基重復(fù), 11個位點為三堿基重復(fù), 且四, 五堿基重復(fù)的次數(shù)均為 5, 三堿基的重復(fù)次數(shù)均為 6。14對引物中最低退火溫度為 50.5℃, 最高退火溫度為 61℃, 擴增片段的長度在90～370 bp。

表1 SSR分析結(jié)果Tab.1 Output statistics of SSR

2.3 里氏擬石磺湛江群體遺傳多樣性分析

對14對SSR引物在取自湛江群體的32個體擴增片段進行統(tǒng)計分析, 14個位點的等位基因數(shù)在2～4之間, 其中Ho和He分別在0.031 3～0.714 3和0.031 3～0.708 4之間, 多態(tài)性信息含量(PIC)在0.089 5～0.640 5之間, 其中 2個微衛(wèi)星位點表現(xiàn)為高度多態(tài)性(PIC>0.5), 10個位點表現(xiàn)為中度多態(tài)性(0.5>PIC>0.25), 2個位點表現(xiàn)為低度多態(tài)性(PIC<0.25)。經(jīng)Sequential Bonferroni校正的Hardy-Weinberg 平衡檢驗, 9個位點不偏離平衡(P>0.05), 其余位點均顯著偏離平衡(0.05>P, 表2)。

表2 14對SSR引物在32個里氏擬石磺擴增特性的描述Tab.2 Primer sequences and characterization of 14 polymorphic microsatellite loci in 32 Paraoncidium reevesii

續(xù)表

3 討論和結(jié)論

SSR是一種應(yīng)用廣泛的分子標(biāo)記。利用高通量測序技術(shù)對里氏擬石磺進行微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)不僅比傳統(tǒng)方法更為快捷, 花費更少, 而且在獲得微衛(wèi)星位點的同時可以查找對應(yīng)EST序列的功能性狀, 與基因關(guān)聯(lián)性較強。相比于基因組SSR, 基于轉(zhuǎn)錄組EST序列開發(fā)的SSR多態(tài)性較低[17], 本實驗共獲得14個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點, 其中2個微衛(wèi)星位點表現(xiàn)為高度多態(tài)性(PIC>0.5), 10個位點表現(xiàn)為中度多態(tài)性(0.5>PIC>0.25), 2個位點表現(xiàn)為低度多態(tài)性(PIC<0.25), 這表明湛江里氏擬石磺野生群體的遺傳多態(tài)性處于中度多態(tài)性水平。14個位點中有5個位點偏離平衡(P<0.05), 可能的原因是種群中有個體產(chǎn)生基因漂變, 或者出現(xiàn)了無效等位基因[18]。

作為海洋無脊椎動物向陸地延伸的過渡物種,石磺科貝類認(rèn)為是研究海洋貝類向陸地輻射生活的最好代表。而利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記來研究水產(chǎn)動物的系統(tǒng)進化已經(jīng)得到廣泛引用: 汪桂玲[19]等曾利用微衛(wèi)星分析五大湖野生三角帆蚌群體的遺傳多樣性和種間發(fā)生關(guān)系; 董秋芬[20]等利用13個微衛(wèi)星位點對 9種石斑魚的種系發(fā)生關(guān)系進行研究。這些都為利用SSR標(biāo)記研究石磺科貝類間種系發(fā)生提供了借鑒。本研究中利用高通量測序技術(shù)開發(fā)的14個微衛(wèi)星位點, 不僅為研究里氏擬石磺的遺傳多樣性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 也可用于石磺科貝類間種系發(fā)生關(guān)系的研究中。

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