日本乙型腦炎LAMP方法的建立和應用

孫圣福 陳靜 田夫林 馬惠玲 楚遵鋒 王敏（山東省動物疫病預防與控制中心 250022）

日本乙型腦炎LAMP方法的建立和應用

孫圣福 陳靜 田夫林 馬惠玲 楚遵鋒 王敏（山東省動物疫病預防與控制中心 250022）

日本乙型腦炎（Japaneseencephalitis，JE，簡稱乙腦）是一種由乙型腦炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）引起的人畜共患的病毒性疾病。對于人類和動物的健康有極大的威脅，主要引起人的神經性疾病以及豬的繁殖障礙。

本研究針對乙型腦炎病毒的M基因設計一套RT-LAMP特異性引物，建立了用于乙腦病毒快速診斷的病原學檢測方法。與傳統的RT-PCR方法相比，該方法操作簡便，時間短，對儀器設備要求較低，檢測結果肉眼下即可觀察結果，臨床應用簡便。

1 材料和方法

1.1 材料

病毒：乙腦減毒克隆98株；臨床病料來自本實驗室門診采集自山東省各市縣養豬場疑似乙腦的病料。

1.2 主要儀器和試劑

凝膠成像及分析系統為美國BIO-RADGEL型，PCR儀為德國Biometra公司生產的Tgradient型，臺式冷凍離心機為德國Sigma2k-15型，生物安全柜為NU-425-400E3型，電泳槽為北京六一儀器廠。

Loopamp試劑盒購自榮研株式會社，SYBRGREENI核酸染料購自Solarbio公司；DL2000DNAMarker、20bpLadder DNAMarker、反轉錄酶M-MLV、一步法RT-PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取試劑Trizol購自大連寶生物公司。日本乙腦RT-PCR檢測試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司。

1.3 引物

根據已經報道的JEV的M基因，利用LAMP引物在線設計軟件PrimerExplorerV4.0設計出RT-LAMP反應中使用的4條特異性引物，引物由TAKARA公司合成，序列如下：

表1 引物序列

1.4 核酸提取

待檢樣品100ul，加Trizol試劑1ml。充分混勻，室溫5min，加三氯甲烷 200ul，混勻，室溫 5min。12000rpm，15min（2～8℃），取上清80%于另一離心管，加入500ul異丙醇， 混勻， 室溫 10min， 12000rpm， 10min（2～8℃）， 棄上清，加75%乙醇洗滌，7500rpm，5min（2～8℃），棄上清，風干，加20ul0.1%DEPC水溶解，-20℃儲存備用。

1.5 RT-LAMP體系優化

根據反應體系優化策略，對反應溫度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度、引物濃度進行優化，反應溫度依次：60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，甜菜堿濃度分別為0.5、1、1.5、2M，內引物濃度分別為1.2、1.6、2.0、2.4μM，外引物濃度分別為0.2、0.4、 0.6、0.8、1.0μm，反應時間：20、30、45、60min，確定最佳的反應體系，25μl反應體系：F3/B3 0.2μm、 FIP/BIP1.6μm、 dNTP0.4mm、 MgSO44mm、 Betaine1M、 BstDNA 聚合酶 1μl、 10×Thermobuffer2.5μl、 AMV反轉錄酶10U，RNA酶抑制劑20U，模板2μl，ddH2O補齊至 25μl。 63℃45min， 80℃2min。 取 6μl擴增產物于 1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，剩余產物中加入1μl核酸染料觀察顏色變化。

1.6 特異性試驗

分別以豬瘟病毒、藍耳病病毒、偽狂犬病毒、豬流感病毒、豬細小病毒、豬圓環病毒等作為樣品，同時設立陰性對照，提取核酸，采用已經優化的反應條件，檢驗所建立的RT-LAMP方法的特異性。

1.7 靈敏性試驗

將病毒樣品進行 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6進行十倍比稀釋，提取核酸，同時設立陰性對照，提取核酸，采用已經優化的反應條件，檢驗所建立的RT-LAMP方法的靈敏性；同時進行RT-PCR試驗，比較兩種方法的靈敏性。

1.8 臨床應用

采集臨床繁殖障礙的豬組織樣品27份，提取核酸，采用建立的RT-LAMP方法和RT-PCR方法同時進行檢測。

2 結果與分析

2.1 反應條件優化

參見圖1～圖4。

圖1 不同溫度梯度

圖2 不同甜菜堿濃度

圖3 不同引物濃度梯度

圖4 不同反應時間

2.2 RT-LAMP特異性試驗

參見圖5。

圖5 RT-LAMP特異性試驗

2.3 RT-LAMP靈敏性試驗

參見圖6～圖7。

圖6 RT-LAMP靈敏性試驗

圖7 RT-PCR靈敏性試驗

2.4 臨床應用

乙腦RT-LAMP臨床應用情況，見表2。

表2 乙腦RT-LAMP臨床應用情況

3 結論

（1）通過RT-LAMP反應條件篩選，確定了乙型腦炎RT-LAMP的最佳反應條件。

（2）通過靈敏性試驗、特異性試驗，確定RT-LAMP能特異性的檢測乙腦病毒，檢測靈敏度為10-5，而RT-PCR檢測靈敏度為10-3，RT-LAMP的靈敏性較RT-PCR高100倍。

（3）RT-LAMP方法反應條件為63℃，只用一個水浴鍋即可完成試驗，檢測結果眼觀，更為直觀，因此適于臨床上應用。

作者：孫圣福（1978-），山東省聊城市人，主要從事動物疫病分子生物學診斷工作。

山東省農業重大應用技術創新課題——規模化豬場豬繁殖障礙病防治與快速檢測技術的研究。