蛋用黑羽鵪鶉微衛星多態性分析

龐有志 吳勝軍 趙淑娟 白俊艷 張小輝 贠銀現 祁艷霞（河南科技大學動物科技學院 471003）

蛋用黑羽鵪鶉微衛星多態性分析

龐有志 吳勝軍 趙淑娟 白俊艷 張小輝 贠銀現 祁艷霞（河南科技大學動物科技學院 471003）

對蛋用黑羽鵪鶉群體9個微衛星座位的遺傳多態性進行分析，旨在為黑羽鵪鶉遺傳資源的評價、保護和利用提供新的依據。結果表明，9個微衛星座位共檢測出46個等位基因，平均每個座位檢測到5.1111個。平均雜合度為0.6952，平均多態信息含量為0.6204，表明蛋用黑羽鵪鶉是遺傳多樣性較豐富的群體。其中有8個微衛星可以作為黑羽鵪鶉群體的有效遺傳標記進行群體遺傳多樣性分析。χ2檢驗表明，9個微衛星座位的基因分布均極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡（P＜0.01）。

黑羽鵪鶉；微衛星；羽色突變；不完全隱性突變；遺傳多樣性；試驗

蛋用黑羽鵪鶉是本課題組最新發現的一種羽色突變，它是來自蛋用中國黃羽鵪鶉與朝鮮鵪鶉配套系的雜種，經分離、純化培育而來。雜交驗證初步證實，該羽色突變是由常染色體發生不完全隱性突變的結果。控制黑羽性狀的基因h位于常染色體上，相對于等位基因H為不完全隱性，該基因座與性染色體Z上的基因座B/b和Y/y具有一定的互作關系[1]。目前關于鵪鶉的微衛星多態性研究并不多，國內僅見王惠影等[2]、常國斌等[3]、Olowofeso等[4]對野生鵪鶉微衛星的研究以及孟慶美等[5]、吳勝軍等[6]對朝鮮鵪鶉研究的相關報道。本研究利用9個具有豐富多態信息含量的微衛星DNA，對新培育的蛋用黑羽鵪鶉進行多態性檢測，旨在探討蛋用黑羽鵪鶉的遺傳多態性，為我國鵪鶉的遺傳資源的評價、保護和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

試驗鵪鶉來自河南科技大學試驗牧場，隨機抽取蛋用黑羽鵪鶉100只，公母各半。每只心臟采血2ml，血樣采用ACD抗凝，血液：ACD為6:1。-20℃冰箱中保存備用。

1.1.2 引物的選擇及合成

從Kayang等[7]建立的鵪鶉微衛星連鎖圖譜中篩選多態性比較高的基因座，確定了9對微衛星基因座作為本次研究的遺傳標記。引物序列送上海生工生物工程技術服務有限公司合成。微衛星座位相關資料見表1。

表1 試驗選用9個微衛星基因座的相關資料

1.2 方法

1.2.1 PCR反應條件

PCR反應體系總體積為12.5μl，其中ddH2O8.65μl，10×Buffer1.25μl， Mg2+（25mmol/L） 0.75μl， DNA 模 板0.5μl，上、 下游引物各 0.5μl（10mmol/L）， dNTPs0.25μl， Taq 酶0.1μl。PCR擴增反應程序：95℃預變性3min；94℃變性45s，X℃退火 60s，72℃延伸 60s，30次循環；最后 72℃延伸12min，4℃保存。退火溫度具體見表1。

表29 個微衛星的等位基因大小和頻率

1.2.2 擴增產物的檢測及聚丙烯酰胺凝膠電泳

擴增產物用1.0×TBE的電泳緩沖液配制成的1%瓊脂糖凝膠進行檢測PCR擴增產物的有無。取PCR擴增產物3μl和等體積的上樣緩沖液混合點樣，電泳，并以DNAmarker作對照，在紫外透射分析儀上觀察是否有所需的條帶，若特異性條帶明亮而且雜帶很少，便可轉到8%非變性丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。120V電泳2h左右，硝酸銀染色后用成像儀拍照保存并分析。根據標準pBR322DNA/MspⅠMarker，檢測等位基因片段大小，確定全部個體在各微衛星座位的基因型。

1.2.3 統計分析

通過分子生物軟件POPGENE（Version1.32）分析每個基因座的多態信息含量（PIC）、有效等位基因數（Ne）、雜合度（H）。對各基因座的基因型分布按照Hardy-Weinerg平衡定律進行χ2檢驗。

2 結果

2.1 微衛星座位聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果

9個微衛星座位在蛋用黑羽鵪鶉群體中都具有明顯的多態性，其中微衛星座位GUJ0023和GUJ0028電泳圖結果詳見圖1和圖2。可以看出微衛星座位GUJ0023和GUJ0028具有豐富的多態性。

圖1 微衛星座位GUJ0023的PCR產物電泳圖

圖2 微衛星座位GUJ0028的PCR產物電泳圖

2.2 微衛星等位基因及其頻率

由表2可見，9個微衛星座位在蛋用黑羽鵪鶉群體中共檢測到46個等位基因，平均等位基因數為5.1111。其中GUJ0023、GUJ0029、GUJ0057、GUJ0077在蛋用黑羽鵪鶉群體中均檢測到6個等位基因，基因片段分別為：219～244bp、147～175bp、 145～170bp、 260～285bp。 GUJ0028、 GUJ0097、GUJ0059在蛋用黑羽鵪鶉群體中均檢測到5個等位基因，基因片段分別為： 160～185bp、 130～170bp、 230～246bp。GUJ083和GUJ0063在蛋用黑羽鵪鶉群體中分別檢測到4和3個等位基因，基因片段分別為：130～155bp、242～246bp。

微衛星位點 GUJ0097、 GUJ0083、 GUJ0077、 GUJ0063、GUJ0059、GUJ0057、GUJ0029、GUJ0028和GUJ0023在黑羽鵪鶉群體中分別有17、9、15、3、11、12、19、14和16種基因型。除了GUJ0028有兩種優勢基因（160bp、180bp）外，其他微衛星位點均只有一種優勢基因。GUJ0097、GUJ0083、 GUJ0077、 GUJ0063、 GUJ0059、 GUJ0057、GUJ0029、GUJ0023優勢基因分別為：147bp、147bp、260bp、 244bp、 246bp、 162bp、 160bp、 240bp。 GUJ0097、GUJ0083、 GUJ0077、 GUJ0063、 GUJ0059、 GUJ0057、GUJ0029、GUJ0028、GUJ0023的優勢基因型分別為：147/147、 155/147、 270/260、 244/244、 246/246、 162/162、 160/160、180/160、240/240。對 9個微衛星座位進行 Hardy-Weinberg平衡檢驗，各基因座位均極顯著偏離遺傳平衡（P＜0.01）。

2.3 微衛星座位的基因雜合度和多態信息含量

由表3可以看出，在黑羽鵪鶉群體中微衛星位點GUJ0077具有最高的多態信息含量為0.7392，GUJ0028具有最高的雜合度為0.7852，同時GUJ0028也具有最高的有效等位基因數為4.6555。9個微衛星在黑羽鵪鶉群體中平均多態信息含量、有效等位基因數、雜合度分別為0.6204、3.5338和0.6952。

表3 9個微衛星等位基因數、多態信息含量、有效等位基因數、雜合度

3 討論

有效等位基因數是純合度的倒數，反映了微衛星位點上所有等位基因之間的相互影響程度。有效等位基因數越接近所檢測到的等位基因的絕對數，表明等位基因在群體中分布越均勻。本研究的9個微衛星位點GUJ0023、GUJ0028、GUJ0029、 GUJ0057、 GUJ0059、 GUJ0063、 GUJ0077、GUJ0083和GUJ0097在鵪鶉總群體中有效等位基因分別為3.8760、 4.6555、 3.7258、 3.0544、 3.2755、 1.8574、 4.4504、2.7255和4.1841，9個微衛星座位的等位基因在群體中分布不均勻。

多態信息含量（PIC）是衡量等位基因片段多態性的理想指標，當PIC＞0.5時，表明該基因座為高度多態基因座；0.25＜PIC＜0.5時表明該基因座為中度多態基因座，PIC＜0.25時表明該基因座為低度多態基因座[8]。本研究所選的9個微衛星座位，除了GUJ0063在黑羽鵪鶉群體中為中度多態性座位外，其余8個微衛星座位均為高度多態座位，表明這8個高度多態基因座位可以作為黑羽鵪鶉群體的有效遺傳標記進行遺傳多樣性分析。

本研究在蛋用黑羽鵪鶉群體9個微衛星座位中共檢測到46個等位基因，平均等位基因數為5.1111，最低為3個，最高為6個，表明這些微衛星座位具有較高的多態性。遺傳雜合度表示在微衛星座位上雜合子個體占畜禽群體的比例，它反映微衛星座位在畜禽群體中的遺傳變異程度，一般認為它是度量群體遺傳變異的一個最適參數。平均雜合度的大小可以近似地反映出遺傳變異程度的高低，雜合度越高，表明群體內遺傳多樣性就越高，遺傳變異程度就越大，反之則群體內遺傳變異程度就小。孟慶美等[5]研究了朝鮮鵪鶉群體12個微衛星的平均雜合度為0.7111，吳勝軍等[6]研究了朝鮮鵪鶉群體9個微衛星平均雜合度為0.7096。Farrag等[9]利用8個微衛星標記在伊朗的4個日本鵪鶉品系中的平均雜合度為0.6090。Hossein等[10]研究表明日本鵪鶉Pharach品系12個微衛星的平均雜合度為0.3873。而本研究的9個微衛星位點在黑羽鵪鶉群體中平均雜合度為0.6952，可以看出，新選育的黑羽鵪鶉群體的遺傳多樣性略低于朝鮮鵪鶉，而高于日本鵪鶉。這為蛋用黑羽鵪鶉的種質資源評價提供了重要依據。

χ2檢驗結果表明，本研究測定的9個微衛星座位在黑羽鵪鶉群體中均極顯著偏離遺傳平衡（P＜0.01）。遺傳平衡與否與檢測樣本含量有一定關系，樣本不夠大時，有些基因座就可能檢測不到全部的等位基因。Baker[11]指出，在檢測每個品種時應分析25個樣本數，為了避免出現誤差樣本數應達到50個。就本研究而言，樣本含量（100）已經達到抽樣的要求，表明遺傳不平衡不是樣本的原因，很可能是黑羽鵪鶉群體受到過度人工選擇或近親繁殖等因素的影響，這與近年來對黑羽鵪鶉進行小群體保種可能有關。

[1]于美琴,龐有志,趙淑娟,等.蛋用鵪鶉黑羽突變基因的遺傳機制及其與伴性羽色基因互作關系的研究 [A].中國動物遺傳育種研究進展——第十五次全國動物遺傳育種學術討論會論文集[C].陜西楊凌,2009:438.

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[3]常國斌,常宏,劉向萍,等.運用微衛星DNA標記分析我國野生鵪鶉遺傳多樣[J].遺傳學報,2005,32(08):795-803.

[4]OlowofesoOlajide,戴國俊,王金玉,等.華東4個鵪鶉群體微衛星標記的遺傳多樣性檢測[J].揚州大學學報(農業與生命科學版),2006,27(01):29-32.

[5]孟慶美,孫永強,李大全,等.朝鮮鵪鶉遺傳多樣性微衛星標記分析[J].福建畜牧獸醫,2007,29(01):1-2.

[6]吳勝軍,龐有志,趙淑娟,等.朝鮮鵪鶉微衛星多態性分析[J].河南農業科學,2010(10):112-115.

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[11]Baker J S.Global protocol for determining genetics distance among domestic livestock breeds[J].Appl Livest Prod,1994,21:501-502.

河南省重點科技攻關項目（082102130002）；河南科技大學校基金項目（2008ZY016）。

龐有志（1963.4-），男，河南省新蔡縣人，博士，教授，碩士研究生導師，主要從事動物遺傳育種研究。