Fe3O4/殼聚糖季銨鹽磁共振造影劑的制備及肝造影性能

宋曉麗 駱夏丹 李 凌 朱愛萍

(1揚州大學化學化工學院，揚州225002)

(2金華市環境科學研究院，金華321000)

Fe3O4/殼聚糖季銨鹽磁共振造影劑的制備及肝造影性能

宋曉麗＊,1駱夏丹2李 凌1朱愛萍＊,1

(1揚州大學化學化工學院，揚州225002)

(2金華市環境科學研究院，金華321000)

采用季銨鹽化殼聚糖(HTCC)對Fe3O4進行表面改性，成功制備在模擬生理環境中懸浮穩定的超順磁性Fe3O4/HTCC復合納米粒。通過動態光散射、透射電鏡、振動樣品磁強計、磁共振等手段對材料的性能進行表征，并考察了其細胞相容性及磁共振造影性能。結果表明：該方法所制備的超順磁性復合納米粒粒徑均一，模擬生理環境中具有良好的分散穩定性；體外實驗表明該磁性納米粒具有良好的細胞相容性；大鼠體內肝臟磁共振造影實驗表明Fe3O4/HTCC納米粒注入后，大鼠肝實質信號強度明顯下降，因此Fe3O4/HTCC納米粒有望作為潛在的陰性造影劑應用于肝磁共振造影檢測。

季銨鹽化殼聚糖；超順磁性四氧化三鐵；分散穩定性；磁共振造影

腫瘤的早期診斷對其治療至關重要。核磁共振成像(MRI)是繼CT后醫學影像學的又一重大進步。MRI利用生物體不同組織在外磁場影響下產生不同的共振信號成像，顯示小病灶或病變區，以期使疑難病變得以確診，實現診斷[1-4]。為了提高對軟組織的分辨率，該過程往往需要造影劑以提高磁共振影像的對比度[5-7]。目前，在我國用于臨床的造影劑一般是釓系列造影劑，該類造影劑在生物體內呈非特異性分布。主要適用于腦、腎和血液系統的成像[8-9]，但該類造影劑體內停留時間短，易解離，弛豫率低且對肝腎有較大的副作用[10]。

超順磁性材料作為MRI造影劑，弛豫速率相對較高，引起了廣泛的關注[11-12]。超順磁性造影劑(SPION)是一種以Fe3O4為主要成分的超順磁性納米微粒。SPION可經靜脈注射后進入肝臟及脾臟的網狀內皮細胞，被肝臟內的枯否細胞攝取，從而呈現低信號。由于正常肝臟存在枯否細胞，而腫瘤內一般沒有或含極少量的枯否細胞，因此SPION可增加腫瘤與肝實質間的對比度，應用于肝臟腫瘤的檢出[13-14]。但表面未被改性的納米Fe3O4易集聚、血液循環時間不夠長、在生理環境下分散不穩定，且較高濃度Fe3O4納米粒易引起鐵毒性，給其臨床應用帶來了困難[15-17]。因此，對Fe3O4納米粒進行表面改性，研發分散穩定的生物相容性SPION，降低其毒性和毒副作用，提高在肝脾部位的造影效果，對于肝臟腫瘤的診斷具有重要意義。

殼聚糖是一種可生物降解的生物相容性天然材料，被廣泛應用于生物醫學領域[18-19]。然而殼聚糖不溶于水，使其應用受到了極大的限制。殼聚糖分子中含有氨基和羥基，可進行化學改性修飾制備多性能殼聚糖衍生物[20-22]，極大地擴大了殼聚糖在生物醫學方面的應用范圍。殼聚糖經季銨鹽化后生成一類殼聚糖衍生物稱為季銨鹽化殼聚糖(N-(2-hydroxyl) propyl-3-trimethyl ammonium chitosan(HTCC))。季銨基團的引入有望使殼聚糖的水溶性及與Fe3O4納米粒的結合能力大大提高，更易形成穩定的Fe3O4/ HTCC復合納米粒。

本文首先制備季銨鹽化殼聚糖衍生物，由于季銨基團帶正電荷，可能對Fe3O4納米粒形成良好的靜電吸附作用，通過簡單攪拌一步法表面改性Fe3O4納米粒，通過透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)，動態光散射(dynamic light scattering，DLS)，磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)及振動樣品磁強計(vibration sample magnetometer，VSM)對其進行表征，并對其生物相容性，肝磁共振造影性能進行研究。

1 實驗部分

1.1 試劑

殼聚糖(CS，5.0×105，脫乙酰度85%)，浙江玉環海洋生物有限公司；2,3-環氧丙基三甲基氯化銨(GTA)，上海西域集團；異丙醇、氯化鐵、硫酸亞鐵、氨水，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 季銨鹽化殼聚糖(HTCC)的合成

0.5 g CS溶于2wt%的醋酸溶液中，逐滴加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液使CS析出，浸泡8 h，抽濾，洗滌至中性，得到白色絮狀殼聚糖。將白色絮狀殼聚糖分散在15 mL異丙醇中，將0.75 g GTA溶解在5 mL異丙醇中。80℃下，緩慢滴加至CS的異丙醇溶液，控制2 h滴完，反應6 h。用無水乙醇將產物沉淀出來，抽濾，干燥，得到季銨鹽化殼聚糖(HTCC)

1.3 Fe3O4納米顆粒的制備

共沉淀方法制備Fe3O4納米粒：準確稱取硫酸亞鐵和氯化鐵，物質的量之比為1:2，移入圓底燒瓶中，溶解于無氧水中并通入氮氣，然后向其中滴加1 mol·L-1氨水，體系中不斷有黑色沉淀物生成。反應結束后體系pH值為13，用無氧水洗滌沉淀物3次，直至pH值為7～8，冷凍干燥得Fe3O4納米粒。

1.4 季銨鹽化殼聚糖表面改性Fe3O4

250 mg冷凍干燥后的Fe3O4加入25 mL HTCC (0.4 mg·mL-1)水溶液中，室溫下500 r·min-1機械攪拌12 h使HTCC充分包覆在Fe3O4表面，高速離心、洗滌3次，冷凍干燥制得Fe3O4/HTCC納米粒，備用。

1.5 表征

采用紅外光譜對HTCC結構進行表征；采用電位滴定法測HTCC的取代度。準確稱取HTCC溶解于去離子水中，配制濃度為0.01 mol·L-1的AgNO3標準溶液進行滴定，以飽和甘汞電極為參比電極，銀電極為工作電極，當電位的變化與滴定體積的變化比值最大時即為滴定終點，由公式(1)計算HTCC的取代度DS。

其中，V為消耗AgNO3的體積(L)，c為AgNO3的標準濃度(mol·L-1)，m1為樣品質量(g)，m2為被取代樣品的質量(g)，m2=Vc×313.5，162為單元殼聚糖分子量，313.5為單元HTCC分子量。

采用TEM觀察納米粒子的尺寸和形貌；VSM測試樣品的飽和磁化強度。

采用DLS及MRI檢測Fe3O4/HTCC的分散穩定性。檢測方法為：將Fe3O4/HTCC納米粒以PBS(pH= 7.4)緩沖液稀釋至200 mg·L-1，取1.5 mL于EP管中，豎直固定靜止1月后，分別進行DLS檢測和MR掃描，其中MR檢測中，觀察EP管中MR信號均勻性，以判斷Fe3O4/HTCC納米粒分散穩定性和MR穩定性。

1.6 細胞毒活性實驗

取HTCC、Fe3O4、Fe3O4/HTCC納米粒于超凈工作臺過0.22 μm微孔濾膜除菌后，分別用PBS緩沖溶液(pH=7.4)稀釋成0.01、0.05、0.1、0.25、0.5 mg· mL-1懸浮液，4℃無菌保存。

K562(5×104)細胞接種于96孔板內，每濃度設6復孔，每孔加入100 μL樣品，空白對照加入100 μL細胞培養基。培養7 d，然后每孔加入MTT(5 mg· mL-1)(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)20 μL，繼續培養4 h后離心，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，室溫震蕩20 min，490 nm酶標儀測OD值。

1.7 Fe3O4/HTCC納米粒的體內MR成像

選取雄性SD大鼠(5月齡，揚州大學動物中心)，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg·kg-1)，然后經靜脈注射Fe3O4/HTCC納米粒PBS懸浮液(0.05 mmol·kg-1)。30 min后，膝關節線圈于GE Signa Echospeed 1.5T MR掃描儀進行成像檢測，掃描參數：PDWI TE 10 ms，TR 3000 ms；視野12～14 cm，矩陣256×224，層厚2～4 mm，層間距0.5～1.0 mm。

圖1 HTCC的結構示意圖Fig.1Structure scheme of HTCC

圖2 殼聚糖和HTCC的紅外光譜圖Fig.2FTIR spectrum of CS and HTCC

圖3 HTCC溶液中滴定體積-電位關系圖Fig.3Potential varition with titration volume of AgNO3in HTCC solution

2 結果與討論

2.1 季銨鹽化殼聚糖的結構表征

本文首先通過開環加合制備HTCC，獲得乳白色粉末，結構如圖1所示。并通過紅外光譜對其結構進行表征。如圖2紅外光譜所示，CS紅外譜特征吸收峰為：3 409 cm-1(O-H伸縮振動)，1 680 cm-1(-NHCOCH3中C=O伸縮振動)，1 600 cm-1(脫乙酰化的-NH2中的N-H彎曲振動)，1 380 cm-1(酰胺三帶的特征吸收，C-N的伸縮振動)，1 163 cm-1(不對稱橋氧伸縮振動)，1 065 cm-1(骨架上的C-O伸縮振動)。從HTCC紅外譜圖中可以清晰地看出，在1 600 cm-1N-H的特征吸收峰的強度降低，這是由于CS中的氨基與GTA中的環氧基團發生了化學反應的結果。與CS的紅外譜圖相比，HTCC的紅外譜在1 486 cm-1出現了一個新的特征吸收峰，這是GTA中-(CH3)3的C-H彎曲振動吸收峰。紅外譜圖結果表明，HTCC成功合成。

為了進一步對HTCC的結構進行表征，采用電位滴定法測定HTCC的取代度。電位滴定以0.01 mol·L-1AgNO3滴定HTCC溶液中的Cl-濃度，從而計算得出HTCC的取代度，由圖3求導獲得滴定體積，公式(1)計算結果表明，本文獲得的HTCC的取代度為31.10%。

2.2 Fe3O4/HTCC納米粒的性質表征

圖4為Fe3O4/HTCC納米粒的TEM圖。由圖可知，Fe3O4/HTCC納米粒的粒徑為(14.5±2.2)nm，形貌大多為球形或類球型，且具有較好的分散性。

圖4 Fe3O4/HTCC納米粒的TEM圖Fig.4TEM morphologies of Fe3O4/HTCCNPs

為了研究Fe3O4/HTCC納米粒的分散性及穩定性，將Fe3O4和Fe3O4/HTCC納米粒分散在PBS(pH= 7.4)緩沖液中，靜置一個月后研究其DLS分布。圖5是Fe3O4和Fe3O4/HTCC納米粒的DLS圖。由圖可知，Fe3O4納米粒的平均粒徑為748 nm，分布系數(PDI)為0.525，說明未經改性的Fe3O4納米粒極易聚集。而Fe3O4/HTCC的平均粒徑為128.3 nm，分布系數(PDI)為0.180。由DLS結果表明Fe3O4/HTCC納米粒的分散穩定性遠遠大于Fe3O4納米粒。這是由于季銨鹽帶正電荷，HTCC表面修飾Fe3O4納米粒后使Fe3O4/HTCC納米粒表面呈現正電性，從而具有較強的靜電排斥作用，足以克服由于磁偶極的相互吸引而產生的聚集作用，因此Fe3O4/HTCC納米粒表現出良好的分散穩定性。

圖5 Fe3O4納米粒和Fe3O4/HTCC納米粒的DLS分布(pH=7.4)Fig.5size of Fe3O4andFe3O4/HTCCNPs by DLS (pH=7.4)

圖6 Fe3O4/HTCC納米粒的MR檢測(a)T2*WI，(b)T1WIFig.6MRI of Fe3O4/HTCCNPsat sequence T2*WI(a) and T1WI(b)

影劑的分散穩定性對于其MR成像至關重要，因此我們又采用MR對Fe3O4/HTCC的分散穩定性進行了檢測。

圖6是Fe3O4/HTCC靜置1月后MR的T2*WI及T1WI圖像，從圖中可以看出，各層面信號均勻，沒有出現由于Fe3O4沉積所導致的磁化偽影。表1是Fe3O4/HTCC T2*WI及T1WI圖像中不同層面相對信號強度，從表中也可以看出，不同層面T2*WI及T1WI序列所測得相對信號強度無顯著性差異。這說明Fe3O4/HTCC靜置一月后分散穩定，這將有利于進行體內磁造影實驗。

造影劑的磁性是進行MRI的關鍵，因此通過VSM研究表面包裹HTCC對Fe3O4納米粒磁性的影響。

圖7是Fe3O4和Fe3O4/HTCC納米粒的VSM圖。由圖7的磁滯回線可知Fe3O4和Fe3O4/HTCC納米粒的矯頑力和剩磁值均為零，說明兩者均具有超順磁性。與Fe3O4粒子(飽和磁化強度67.4 emu·g-1)相比，Fe3O4/HTCC納米粒的飽和磁化強度稍有降低，這是由于聚合物表面呈現磁惰性所致。然而其飽和磁化強度仍達64.41 emu·g-1，可以應用于磁造影。

表1 Fe3O4/HTCC不同層面T2*WI及T1WI序列的相對信號強度Table 1Relative signal strength at different levels of Fe3O4/HTCC NPs tubes

圖7 Fe3O4和Fe3O4/HTCC納米粒的磁性圖Fig.7Magnetization curve of Fe3O4NPs and Fe3O4/ HTCC NPs

圖8 HTCC、Fe3O4及Fe3O4/HTCC納米粒的細胞相容性(培養7 d)Fig.8Cytocompatibility of HTCC,Fe3O4and Fe3O4/HTCC NPs for 7 days of cell culture

2.3 HTCC、Fe3O4及Fe3O4/HTCC納米粒的細胞相容性

圖8是K562細胞分別與HTCC、Fe3O4和Fe3O4/ HTCC納米粒作用后的存活情況。從圖中可以看出，培養7 d后，HTCC、Fe3O4、Fe3O4/HTCC納米粒濃度從0 mg·mL-1增加到0.5 mg·mL-1，細胞存活率呈下降趨勢，當濃度低于0.05 mg·mL-1時，細胞7 d后的存活率均大于90%，而當濃度高于0.05 mg·mL-1時，細胞與HTCC和Fe3O4/HTCC納米粒作用7 d后的存活率仍然超過80%，而細胞與Fe3O4作用7 d后，其存活率降為70%左右(P＜0.05)，表明Fe3O4經HTCC修飾后可以有效改善其細胞相容性，Fe3O4/ HTCC納米粒可用作潛在的造影劑。

2.4 Fe3O4/HTCC納米粒的體內MR成像

圖9是注射前及注射Fe3O4/HTCC納米粒后大鼠腹腔MRI圖，從圖中可以看出，注射Fe3O4/HTCC納米粒前，大鼠肝實質信號強度與其他器官差別不明顯，注射Fe3O4/HTCC納米粒后，大鼠肝實質信號強度明顯下降。這說明Fe3O4/HTCC納米粒可作為陰性對比劑用于肝核磁共振造影。

圖9 注射前及注射Fe3O4/HTCC納米粒后大鼠肝臟MRI圖Fig.9MRI images of rat liver before(a)and after(b)injection of Fe3O4/HTCC NPs

3 結論

(1)通過帶正電荷的季銨鹽化殼聚糖衍生物，表面改性Fe3O4納米粒，成功制備出具有較強的超順磁性和良好的細胞相容性且在pH=7.4的模擬生理環境中具有良好分散穩定性的Fe3O4/HTCC納米粒。

(2)Fe3O4/HTCC納米粒在PH＝7.4的模擬生理環境中MRI信號均勻，注射Fe3O4/HTCC納米粒后大鼠肝實質信號強度明顯下降。表明Fe3O4/HTCC納米粒可作為陰性對比劑用于肝核磁共振造影。

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Preparation and Liver MRI of Fe3O4/N-(2-Hydroxyl)propyl-3-trimethyl Ammonium Chitosan Contrast Agent

SONG Xiao-Li＊,1LUO Xia-Dan2LI Ling1ZHU Ai-Ping＊,1
(1College of Chemistry and Chemical Engineering,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu 225002,China)
(2Jinhua Research Academy of Environmental Sciences,Jinhua,Zhejiang 321000,China)

Supermagnetic Fe3O4/N-(2-hydroxyl)propyl-3-trimethyl ammonium chitosan nanoparticles were synthesized by combining Fe3O4and CS chemically modified with glycidyl trimethyl ammonium chloride.Properties of the obtained nanoparticles were investigated by transmission electron microscopy,dynamic light scattering,magnetic resonance imagingandvibrationsamplemagnetometer.Thecytocompatibilityofthenanoparticleswereassessed.Then the in vivo MRI of the nanoparticles were confirmed.The results demonstrate that the nanoparticles are uniform and stable in simulated physiological environment.Also the nanoparticles show good cyto-compatibility.The in vivo results show that the parenchyma signal intensity of rats liver is significantly decreased after injection of the nanoparticles.Thus it indicatesthatthenanoparticleshavepotentialapplicationinliverMRI asanegativecontrast.

N-(2-hydroxyl)propyl-3-trimethyl ammonium chitosan;supermagnetic Fe3O4;suspension stablility;magnetic resonance imaging

O614.81+1

A

1001-4861(2015)10-1987-06

10.11862/CJIC.2015.230

2015-03-11。收修改稿日期：2015-06-26。

國家自然科學基金(No.21201149)；江蘇省自然科學基金(BK2012259)資助項目。

＊通訊聯系人。E-mail：xlsong@yzu.edu.cn，apzhu@yzu.edu.cn；會員登記號：S06N7485M1405。