寧夏回族人群TCF7L2基因rs290487位點多態性與2型糖尿病的關聯性分析

楊 易，祁愛琴，郝秀靜，徐金瑞

（寧夏大學 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

我國糖尿病患者人數近1億，其中2型糖尿?。╰ype 2diabetes mellitus，T2DM）患者約占95%。遺傳因素與環境因素共同決定了T2DM的發生［1－2］。T2DM的主要病理生理改變是胰島素的分泌缺陷和胰島素抵抗［3］，因此與胰島素分泌、胰島素信號傳導通路和胰島β細胞凋亡相關的基因是T2DM發病機制研究的重要候選基因。全基因組關聯研究（genome－wide association study，GWAS）顯示：轉錄因子7類似物2（transcription factor 7like 2，TCF7L2）基因異常表達與T2DM 的發生有關聯［4－6］。TCF7L2基因又稱T細胞轉錄因子4（T cell factor－4，TCF4），位于人類染色體10q25.3，長度為215.9kb，包括14個外顯子。其表達產物是Wnt信號傳導通路的關鍵因子，對胰島β細胞功能有調控作用。TCF7L2基因發生變異最終導致β細胞功能缺陷，胰島素分泌不足［7］。TCF7L2基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs） 與T2DM的發生有一定關聯性，但對不同種族或人群的研究結果存在差異性［8－10］。rs290487位點位于TCF7L2基因7號內含子上，在10號染色體上位置為114909731。目前在該位點上的研究沒有其他位點廣泛，且得出的結論亦不一致［11］。目前，尚未見TCF7L2基因rs290487位點多態性與寧夏回族人群T2DM關聯性研究的相關報道。本研究采用聚合酶鏈式反應－限制性片段長度多態性（polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）分型方法，對寧夏回族健康個體和T2DM患者TCF7L2基因rs290487位點多態性進行檢測，并通過遺傳統計分析，旨在揭示該位點多態性與T2DM的關聯性，以期為寧夏回族人群T2DM的早期預防提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 所用血樣來源于2011年寧夏醫科大學附屬醫院和寧夏回族自治區人民醫院住院患者及體檢者，其中健康者109名（對照組），T2DM患者111例（T2DM組），年齡30～80歲。個體間均無血緣關系，且3代均為回族，在寧夏回族自治區居住3代以上。根據知情同意的原則，采研究對象的外周靜脈血樣本用于提取基因組DNA。T2DM納入標準參照1999年WHO的T2DM診斷標準和1999年10月我國糖尿病學會的中國人群T2DM診斷標準，并排除1型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他特殊類型的糖尿病。

1.2 基因組DNA提取 采用常規酚／氯仿提取法提取基因組DNA。

1.3 引物設計 根據GenBank中TCF7L2基因序列設計引物，擴增rs290487位點所在目的片段，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列：F，5′－AGGAGGCTGCCATATTGTTTACTT－3′；R，5′－ACACCTTTCTCATTTTCAATTTCGC－3′，擴增片段長度為153bp。

1.4 PCR反應 反應體系20μL，其中DNA模板（40mg·L－1）1.0μL，上下游引物各0.5μL，2 × Reaction Mix 9.5 μL，Golden DNA Polymerase（2.5U·μL－1）0.5μL，滅菌三蒸水8.0μL。PCR反應條件：94°C預變性5min；94°C變性30s，61℃退火30s，72°C延伸1min，30個循環；72°C延伸10min，4°C保存。擴增完成后，取PCR產物3μL，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 酶切反應 在20μL酶切體系中，加入PCR產物6μL，10×酶切緩沖液2μL，限制性內切酶（10U·μL－1）0.5μL，滅菌三蒸水 11.5μL。37℃水浴酶切6h后，采用3.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物。

1.6 基因型分析 根據酶切產物判斷個體基因型，3種基因型對應的酶切產物分別為TT：153bp；CT：153bp、128bp和25bp；CC：128bp和25bp。

1.7 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析。對照組與T2DM組研究對象的基因型和等位基因頻數分布分析采用Hardy－Weinberg平衡檢驗，組間比較采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1 PCR反應結果 擴增出的片段大小與預期大小一致，長度為153bp，且條帶清晰，可用于后續酶切反應。見圖1。

圖1 rs290487位點PCR產物電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR products of rs290487site

2.2 PCR產物酶切反應結果 在對照組和T2DM組中均檢出3種基因型，分別為TT、CT和CC。見圖2。

圖2 rs290487位點PCR產物AccⅡ酶切電泳圖Fig.2 Electrophoregram of PCR products of rs290487site digested by AccⅡenzyme

2.3 2組研究對象基因型和等位基因頻數分布在對照組和T 2DM組研究對象中基因型頻數分布符合 Hardy－Weinberg平衡定律（χ2＝4.021，P＞0.05；χ2＝1.581，P＞0.05），具有群體代表性。見表1。

表1 2組研究對象rs290487位點基因型頻數分布的Hardy－Weinberg平衡性檢驗Tab.1 Hardy－Weinberg equilibrium test for genotypic frequency distribution at rs290487site of TCF7L2gene

T2DM組和對照組研究對象基因型、等位基因頻數頻數分布：rs290487位點3種基因型TT、CT和CC在對照組研究對象中的頻數分別為31.19%、40.37%和28.44%，在T2DM組的頻數分別為24.32%、55.86%和19.82%，基因型頻數分布組間比較差異無統計學意義（χ2＝5.370，P＞0.05）；等位基因T和C在對照組中的頻數分別為51.38%和48.62%，在T2DM組的頻數分別為52.25%和47.75%，等位基因型頻數分布組間比較差異無統計學意義（χ2＝0.034，P＞0.05）。見表2。

表2 2組研究對象rs290487位點基因型和等位基因頻數分布Tab.2 Distribution of genotypic and allelic frequencies at rs290487site of objects in two groups ［n（η／%）］

3 討 論

SNPs是基因組變異中最常見的一種形式，在人類基因組中大概每1000個堿基中就有1個SNP。不同人之所以對疾病的易感程度有所區別，對藥物會產生不同反應，部分受到SNP影響。SNP作為第3代遺傳標記，在復雜疾病的基因定位、關聯分析、個體疾病易感性分析和藥物基因組學的研究中發揮著愈來愈重要的作用。

國內外學者對不同人種TCF7L2基因SNPs位點與T2DM發生的關聯性的研究結果表明：T2DM本身具有高度遺傳異質性，不同地區和不同種族人群的遺傳背景不同，且生活習慣、環境因素等方面也有很大差異。TCF7L2基因變異型增加T2DM的發病風險的原因：在胰島β細胞中過表達，Wnt信號通路異常，導致前胰島素加工障礙，胰島素分泌減少，腸促胰島素的水平下降，肝糖原輸出水平增加，以及胰島淀粉樣蛋白沉積，影響胰島β細胞功能，并使胰島凋亡增加。

本研究采用PCR－RFLP法對寧夏回族健康個體和T2DM患者外周血中TCF7L2基因rs290487位點多態性進行檢測，結果表明：TCF7L2基因rs290487位點多態性與寧夏回族人群T2DM的發生無關聯。目前已有國內學者對不同地區人群TCF7L2基因rs290487位點多態性與T2DM的關聯性進行了研究。Chang等［12］對中國臺灣漢族人群、Ren等［13］對中國漢族人群、邊澈等［14］對中國沈陽地區漢族人群的研究結果均表明：TCF7L2基因rs290487位點多態性與T2DM的發生有關聯。而張勇等［1］對中國濟南地區人群、紀紅梅等［15］對中國遼寧地區人群、鄒云蓮等［16］對中國昆明地區漢族人群的研究結果均表明：TCF7L2基因rs290487位點多態性與T2DM的發生無關聯。任倩等［17］對中國臺灣、安徽和黑龍江省3個地區人群的多態性研究進行薈萃分析，合計樣本量，使用隨機效應模型選取T2DM患者9422例，正常人8585名，結果未發現rs290487位點多態性與T2DM發生有關聯。

綜上所述，TCF7L2基因與T2DM發生的關聯性研究結果在我國呈現出較強的異質性。本研究中TCF7L2基因rs290487位點多態性與寧夏回族人群T2DM發生未表現出關聯性，這是否因樣本量原因所致，還有待進一步擴大樣本量、充實實驗指標和實驗數據進行驗證。

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