DNMT3b基因多態性及其在胃癌組織中的表達水平與胃癌的關聯性分析

王 川，賈志芳，曹東慧，武 興，曹雪源，姜 晶

（1.吉林大學第一醫院臨床流行病學研究中心，吉林 長春 130021；2.吉林大學第一醫院胃結直腸外科，吉林 長春 130021）

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，發病率和死亡率均位于第3位［1］。中國成年人中有50%以上感染幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp），但只有少數個體最終發展成胃癌，提示宿主遺傳因素在胃癌的易感性方面有重要作用［2］。隨著近年來胃癌分子遺傳學研究的深入，與基因轉錄過程相關酶的基因多態性研究得到了廣泛開展。DNA甲基化是常見的表觀遺傳修飾，由DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）家族催化，包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b［3］。DNMT3b的主要功能是參與從頭甲基化，以非甲基化的DNA為模板，催化新的甲基化位點形成［4］。抑癌基因啟動子區CpG島如果呈現高甲基化狀態，則抑癌基因失活。國內外研究［5］顯示：胃黏膜組織中異常表達的DNA甲基轉移酶，可能為癌癥發生的早期階段創造了條件。個體單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）差異可能使DNA甲基轉移酶的表達水平不同，從而使得個體對腫瘤的易感性存在差異。已有研究［6－7］結果顯示：DNMT3b基因多態性與人類結直腸癌、肺癌等腫瘤易感性有關。目前國內對DNMT3b基因多態性的研究多局限于啟動子區或單個SNPs位點。本研究選擇DNMT3b基因的5個SNPs位點，采用病例對照研究方法，探討DNMT3b基因多態性是否影響其蛋白表達水平及其與胃癌的關系，為胃癌的病因學研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 采用病例對照設計。病例組為2008—2010年本院收治的胃癌患者，共447例。病例組納入標準：來自吉林省長春市，中國北方漢族人，年齡30～90歲，在本院胃結直腸外科行手術治療，并經病理報告明確診斷為非賁門部胃癌；其中男性322例，女性125例，年齡35～90歲，平均年齡（61.70±11.09）歲。對照組為同時期在本院體檢中心體檢的健康對照者，共961名，其中男性564名，女性397名，年齡35～79歲，平均年齡（50.40±8.51）歲。對照組納入標準：血清Hp－IgG檢測陰性（＜30EIU），無萎縮性胃炎和惡性腫瘤史，常規體檢結果均正常，按年齡、性別頻數匹配挑選。排除標準：年齡小于30歲或大于90歲者，非中國漢族北方人群，并發其他嚴重疾病可能會影響到胃癌病情進展者。所有受試者均知情同意，研究方案經本院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器 HpIgG抗體（Biohit公司，芬蘭），全血基因組DNA提取試劑盒（Axygen公司，美國）；Multiskan GO1510全波長酶標儀（Thermo Fisher Scientifc公司，美國），S1000TM熱循環儀（Bio－Rad公司，美國）?；蚍中蜋z測由美國Applied Biosystems公司完成。

1.3 Hp感染檢測和基因組DNA提取 采集所有研究對象外周血500μL并冷凍保存（EDTA K2抗凝，－80℃）。酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測所有研究對象血清中HpIgG抗體（Biohit公司，芬蘭），使用Multiskan GO 1510全波長酶標儀檢測450nm波長處的吸光度（A）值，計算樣本的酶免疫單位（EIU）數值，結果≥30EIU判定為陽性。使用Axyprep血基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，按照說明書進行操作。

1.4 SNPs位點的選擇和分型 使用SNP browser軟件篩選HapMap數據庫中國漢族人群DNMT3b基因的標簽SNP位點，要求最小等位基因頻率（MAF）＞0.10，同時r2＞0.8。共22個SNPs位點滿足 MAF＞0.10，其中18個SNPs顯示與標簽SNPs的完全連鎖不平衡（D′＝1，r2＞0.8），最終選擇了rs6119954、rs4911107、rs4911259和rs8118663共4個標簽SNPs位點以及基因啟動子區rs1569686位點進行測定，采用TaqMan技術確定每個SNPs位點的基因分型。BIO－RAD S1000TM熱循環儀設置的擴增程序：95°C、10min，95°C、15s，60°C、1min，共40個循環。

1.5 免疫組織化學法檢測胃癌組織和癌旁組織中DNMT3b多態性與基因表達的關系 采用鏈霉素－生物素－過氧化物酶法對104例胃癌患者的胃癌組織和85例患者的癌旁對照組織進行了免疫組織化學染色，由2名獨立的病理學家進行評分。采用HSCORE評分系統評估染色強度及特定強度范圍內細胞染色的百分比：HSCORE＝∑Pi（i）（i＝0，1，2，3，Pi＝0～100%）。i代表腫瘤細胞的染色強度（無染色＝0，弱染色＝1，中度染色＝2，強染色＝3），Pi是每一個強度下腫瘤細胞染色的百分比，范圍0～100%。HSCORE總分為各強度得分之和，結果為0～300，依據表達水平的高低分為高表達（HSCORE＞200）、中度表達（100＜HSCORE＜200）、低表達（HSCORE≤100）和陰性（HSCORE＝0），結果以中位數（四分位數）表示。

1.6 統計學分析 采用SAS 9.2統計軟件進行統計學分析。采用擬合優度χ2檢驗分析對照組研究對象的基因型頻率分布是否符合Hardy－Weinberg（H－W）平衡。病例組和對照組研究對象的基因型及其他指標的分布情況比較采用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法。調整性別、年齡和Hp感染的作用后，采用非條件Logistic回歸分析計算基因型與胃癌危險性的OR值及95%可信區間（CI）。DNMT3b基因多態性與表達水平的關聯分析采用Mann－Whitney U 檢驗或Kruskal－Wallis H 檢驗。

2 結 果

2.1 研究對象的一般特征 與對照組比較，病例組患者的年齡大，男性所占比例高，故后續的統計分析均調整了年齡和性別因素的影響；病例組患者中Hp抗體陽性率明顯高于對照組（69.1%vs 49.7%，P＜0.001）；病理分期方面，病例組進展期胃癌患者居多，Ⅱ、Ⅲ期共占72.7%；分化程度方面，低分化者占62.9%；Lauren分型顯示病例組腸型胃癌為主要病理類型，占68.2%。2組研究對象的一般特征見表1。

2.2 DNMT3b基因多態性與胃癌的關聯性 對照組研究對象DNMT3b的5個SNPs位點rs6119954、rs1569686、rs4911107、rs4911259和rs8118663均進行了 Hardy－Weinberg平衡檢驗，其P 值分別為 0.036、0.321、0.341、0.362和0.874。rs1569686、rs4911107、rs4911259和rs8118663均符合Hardy－Weinberg平衡，但rs6119954偏離了Hardy－Weinberg平衡，隨機挑選了100例研究者進行了實驗驗證，結果相同，故仍將該位點納入分析。調整年齡、性別和Hp感染等因素，利用非條件Logistic回歸分析DNMT3b基因多態性與胃癌的關聯結果表明：與攜帶GG基因型比較，攜帶rs6119954AA基因型的個體發生胃癌的危險性是其1.25倍（95%CI：0.86～2.10，P＝0.19）。在其他4個SNPs位點上，同樣均未發現DNMT3b基因多態性與胃癌的發生有關聯。見表2。

表1 研究對象的一般特征Tab.1 General characteristics of subjects［n（η／%）］

2.3 DNMT3b基因多態性和胃癌組織中DNMT3b蛋白表達水平的關系 免疫組織化學染色結果顯示：多數患者DNMT3b蛋白在胃癌組織的細胞核中呈高表達，僅在少數患者胃癌組織的細胞質中呈弱表達。在胃癌組織中DNMT3b的HSCORE為180（140～240），癌旁對照組織中DNMT3b的HSCORE為90（0～240），胃癌組織中DNMT3b的表達水平顯著高于癌旁對照組織（P＜0.001）。DNMT3b基因的5個SNPs的不同基因型間DNMT3b蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

3 討 論

DNA異常甲基化導致的抑癌基因失活在腫瘤早期發生過程中起重要作用［8－9］。既往對DNMT3b基因多態性的研究［10］中，大都局限于啟動子區單個轉錄起始位點（如－149C→T），本研究通過SNPs數據庫篩選，挑選出覆蓋DNMT3b基因的4個標簽SNPs，還添加了1個位于啟動子區域的SNP，更全面地分析了DNMT3b基因多態性與胃癌之間的關系。

表2 病例組和對照組DNMT3b基因型頻數分布Tab.2 Distribution of genotypic frequencies of DNMT3bin case and control groups

表3 DNMT3b基因多態性與胃癌組織中DNMT3b蛋白表達水平的關系Tab.3 Relationship between DNMT3bgene polymorphisms and expression level of DNMT3bprotein in gastric cancer tissue

Hu等［11］研究發現：啟動子區轉錄起始點上游－579G＞T位點（rs1569686）的基因多態性與胃癌的易感性相關，與對照組比較，攜帶G等位基因的個體患胃癌的易感性顯著降低。本研究雖然在更大規模的中國人群中進行驗證，卻未發現rs1569686基因多態與胃癌的易感性有關聯。有研究［12－13］顯示：DNMT3b基因啟動子區－149位的SNP（rs2424913）T等位基因變異可以使轉錄活性增加30%，使DNMT3bmRNA和蛋白表達水平升高，T等位基因攜帶者患肺癌風險幾乎是CC型的2倍，而乳腺組織中攜帶C等位基因者更易罹患乳腺癌，因此研究者們也關注了rs2424913位點與胃癌發生的關系［10－11，14］。Aung等［15］對日本人群進行了研究，在病例組與對照組中未發現等位基因頻率分布的差異，這與 Wang等［10］和Hu等［11］對中國人群的研究結論一致。不同研究結果的差異可能是由于SNPs的罕見基因型頻率在不同種族間分布差異引起的，中國漢族人群和日本人群rs2424913位點的C等位基因頻率分別為1.2%和0.6%，而美國白人C等位基因的頻率為59.7%（HapMap數據庫的檢索結果），因此以中國漢族人群和日本人群為對象的研究其檢驗效能不足，難以發現rs2424913和胃癌之間的關聯。由于本研究中病例組人數僅為447人，漢族人群中C等位基因的頻率也僅為1.2%，其檢驗效能遠低于0.8，因此本研究未納入該位點。Yang等［14］在中國南方人群中對DNMT3b的rs2424908SNP進行了研究，但未發現rs2424908SNP與胃癌發生有關聯，由于rs2424908和rs8118663有完全的連鎖不平衡（D′＝1，r2＝1），本研究則選擇rs8118663進行研究，同樣未發現其基因變異與胃癌發生有關聯。本研究所選取的胃癌患者均為非賁門癌，而在Yang等［14］的研究中包括了賁門癌和非賁門癌的患者，目前公認這2種組織類型的胃癌在病因、生存和預后方面存在明顯差異，因此病例的抽樣是否導致結論發生偏倚還需要更大規模研究的驗證。

蛋白質是基因表達的產物，其功能是參與維持DNA甲基化狀態，本文作者推測腫瘤組織中如能檢出DNMT3b蛋白的高表達，可能提示DNMT3b參與了腫瘤的形成。Su等［16－17］研究發現：DNMT3b主要在原發性胃腫瘤中過表達，這種表達水平上的差異與臨床病理學有關聯，同時Hp感染可能導致DNMT3b高表達。本課題組雖然發現了胃癌患者腫瘤組織中DNMT3b蛋白高表達，但未發現胃癌患者中攜帶不同基因型的個體腫瘤組織中DNMT3b表達的差異。因此腫瘤組織中DNMT3b高表達可能來源于表觀遺傳學改變和蛋白翻譯后修飾，而與基因多態性無關聯。

綜上所述，DNMT3b基因的rs6119954、rs1569686、rs4911107、rs4911259和rs8118663位點的SNPs與胃癌的發病風險無關聯，并且該基因多態性與DNMT3b蛋白表達水平也無關聯，提示DNMT3b基因多態性在中國北方漢族人群中尚不能作為預測個體對胃癌易感性的遺傳標記。

［1］Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008 ［J］.Int J Cancer，2010，127（12）：2893－2917.

［2］Saeki N，Ono H，Sakamoto H，et al.Genetic factors related to gastric cancer susceptibility identified using agenome－wide association study［J］.Cancer Sci，2013，104（1）：1－8.

［3］Jeltsch A.Molecular enzymology of mammalian DNA methyltransferases［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2006，301：203－225.

［4］張麗麗，吳建新.DNA甲基化－－腫瘤產生的一種表觀遺傳學機制 ［J］.遺傳，2006，28（7）：880－885.

［5］殷 科，盛賢能，郭 宇，等.DNMT1、DNMT3b在胃癌中的表達及其臨床意義 ［J］.現代實用醫學，2013，25（12）：1386－1388.

［6］Daraei A，Salehi R，Mohamadhashem F.DNA－methyltransferase 3B39179G＞T polymorphism and risk of sporadic colorectal cancer in a subset of Iranian population［J］.J Res Med Sci，2011，16（6）：807－813.

［7］Lee SJ，Jeon HS，Jang JS，et al.DNMT3Bpolymorphisms and risk of primary lung cancer［J］.Carcinogenesis，2005，26（2）：403－409.

［8］Samudio－Ruiz SL，Hudson LG.Increased DNA methyltransferase activity and DNA methylation following epidermal growth factor stimulation in ovarian cancer cells［J］.Epigenetics，2012，7（3）：216－224.

［9］鮑 倩，何幫順，陳麗萍，等.DNA甲基轉移酶3B基因啟動子單核苷酸多態性與結直腸癌的相關性 ［J］.中華預防醫學雜志，2012，46（1）：53－57.

［10］Wang YM，Wang R，Wen DG，et al.Single nucleotide polymorphism in DNA methyltransferase 3Bpromoter and its association with gastric cardiac adenocarcinoma in North China［J］.World J Gastroenterol，2005，11（23）：3623－3627.

［11］Hu JB，Fan H，Liu DS，et al.DNMT3Bpromoter polymorphism and risk of gastric cancer ［J］.Dig Dis Sci，2010，55（4）：1011－1016.

［12］Shen HB，Wang L，Spitz MR，et al.A novel polymorphism in human cytosine DNA－methyltransferase－3Bpromoter is associated with an increased risk of lung cancer［J］.Cancer Res，2002，62（17）：4992－4995.

［13］Montgomery KG，Liu MC，Eccles DM，et al.The DNMT3BC→T promoter polymorphism and risk of breast cancer in a British population：a case－control study ［J］.Breast Cancer Res，2004，6（4）：390－394.

［14］Yang XX，He XQ，Li FX，et al.Risk－association of DNA methyltransferases polymorphisms with gastric cancer in the Southern Chinese population ［J］.Int J Mol Sci，2012，13（7）：8364－8378.

［15］Aung PP，Matsumura S，Kuraoka K，et al.No evidence of correlation between the single nucleotide polymorphism of DNMT3Bpromoter and gastric cancer risk in a Japanese population［J］.Oncol Rep，2005，14（5）：1151－1154.

［16］Su XW，Lv CY，Qiao FC，et al.Expression pattern andclinical significance of DNA methyltransferase 3Bvariants in gastric carcinoma［J］.Oncol Rep，2010，23（3）：819－826.

［17］周 寧，李象霖，張月萍，等.甘肅地區人群雌激素受體α－29位基因多態性與HBV感染轉歸的關系 ［J］.臨床肝膽病雜志，2014，30（2）：128－131.