尤瑞克林對腦缺血再灌注大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R表達水平的影響及其機制

王杰華，李國前，楊小霞，洪諸權

（福建醫科大學附屬泉州第一醫院神經內科，福建 泉州 362000）

腦缺血性損傷后機體組織中有一個復雜的、多基因作用的神經保護網絡，其中胰島素樣生長因子1（insulin－like growth factor 1，IGF－1）在該網絡中起重要作用［1－2］。IGF－1作為一種特異性神經營養因子，可維持神經細胞生長、抑制其凋亡，并有助于神經細胞受損后的功能恢復［3］。尤瑞克林可以減少腦缺血損傷面積，減輕神經功能損傷［4］，但其具體作用機制尚未明確。本研究采用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，給予尤瑞克林進行干預，探討尤瑞克林對IGF－1和胰島素樣生長因子1受 體（insulin－like growth factor 1receptor，IGF－1R）表達的影響和意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 成年雄性SD大鼠24只，體質量250～300g，由福建醫科大學實驗動物中心提供（使用許可證號：SCXK閩20042002）。注射用尤瑞克林（0.15PNAU／瓶，廣東天普生化醫藥股份有限公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒（立陶宛 MBI Fermentas公司）；兔抗大鼠IGF－1和IGF－1R抗體（美國Santa Cruz公司）；即用型免疫組織化學試劑盒（鼠／兔，福州邁新生物技術開發有限公司）；β－actin和辣根酶標記IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Beyo ECL和Western熒光檢測試劑（中國碧云天生物技術公司）；引物合成由上海生物工程有限公司完成。

1.2 動物分組及給藥 24只大鼠隨機分為假手術組、模型組和實驗組，每組8只。模型組和實驗組參考改良Longa線栓法［5］制備大鼠大腦中動脈栓塞模型。血流阻斷2h后拔出線栓，形成再灌注。

假手術組大鼠接受相似手術處理，但是不插入線栓。實驗組大鼠于再灌注后5min靜脈注射尤端克林（用滅菌生理氯化鈉溶液稀釋至3.5×10－3PNAU·kg－1），劑量為1mL·kg－1。假手術組和模型組大鼠正常喂養。

1.3 模型處理和取材部位 大鼠再灌注48h后，以10%水合氯醛腹腔麻醉后，仰臥固定，迅速開胸暴露心臟。經左心室行主動脈插管，剪開右心耳作為灌注液流出口，在10～20min內經左心室灌注200mL生理鹽水快速沖洗，取出全腦，濾紙吸去表面水分，去除嗅球、小腦和腦干。冰盤上迅速分離大腦半球，棄去左側大腦半球，取右側半球，取大鼠視交叉后6～11mm處的腦組織備用。

1.4 RT－PCR 法 檢 測 大 鼠 腦組織 中 IGF－1和IGF－1RmRNA的表達 IGF－1上游引物序列：5′－TGCAAAGGAGAAGGAAAGGAAG－3′，下游引物序列：5′－TCAGCAGCCAAAATTCAGAGAG－3′，擴增產物長度為499bp；IGF－1R上游引物序列：5′－AAACGCTGACCTCTGTTACCTCTC－3′，下游引物序列：5′－GCGGATGAAGCCTGATGGAC－3′，擴增產物長度為505bp；內參β－actin上游引物序列：5′－ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT－3′，下游引物序列：5′－AGCTGTGGTGGTGAAGCTGTAG－3′，擴增產物長度為269bp。取缺血側腦組織按Trizol法提取總RNA并進行逆轉錄反應。PCR擴增反應條件：94℃、30s，64℃、30s，72℃、30s，共34個循環。反應完畢后擴增產物進行電泳，半定量分析電泳條帶的吸光度（A）值，結果以目的基因與β－actin A值的比值表示。

1.5 免疫組織化學法檢測大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R的表達水平 大鼠腦組織切片經脫蠟至水，30mL·L－1H2O2室溫孵育5～10min，高壓修復2～5min；加入一抗兔抗大鼠IGF－1和IGF－1R抗體（工作濃度約為1∶100），4℃濕盒孵育過夜；再加入滴加生物素化小鼠抗兔的二抗，室溫30min，AEC顯色10～20min（顯微鏡下控制顯色程度）；自來水充分沖洗，終止反應，蘇木素復染；滴加水性封片劑，干燥后中性樹膠封片。各步驟間用0.01mol·L－1PBS沖洗5min×3次，以陽性細胞計數表示IGF－1和IGF－1R的表達水平。陽性細胞計數：在400倍光學顯微鏡下分別隨機選取5個視野，分別計數免疫反應陽性的細胞數。

1.6 Western blotting法檢測大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白的表達水平 取大鼠缺血側腦組織100mg置于玻璃勻漿器中，加入裂解液，嚴格按照說明書進行蛋白提取，然后采用BCA法測定蛋白濃度。取25μg蛋白，變性后垂直電泳，電轉至PVDF膜，用含10%脫脂奶粉的TBS室溫封閉2h，分別加入一抗（兔抗大鼠IGF－1和IGF－1R抗 體，1∶500；兔抗大鼠β－actin 抗體，1∶1500），4℃ 孵育過夜，用含0.1%Tween－20 的TBS洗滌3次，然后與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶2000）室溫孵育1h，重復洗滌3次，最后用ECL液顯色，X片顯影、定影。采用Image J圖像分析測定Western blotting條帶的灰度值，結果以IGF－1、IGF－1R與β－actin灰度值的比值表示。

1.7 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R mRNA和蛋白表達水平、IGF－1和IGF－1R陽性細胞數以表示，組間比較采用方差分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA表達水平 假手術組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA呈低水平表達。實驗組和模型組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA表達水平高于假手術組（P＜0.05）。實驗組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA表達水平高于模型組（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA表達水平Tab.1 Expression levels of IGF－1and IGF－1RmRNA in brain tissue of rats in various groups （n＝8，）

表1 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA表達水平Tab.1 Expression levels of IGF－1and IGF－1RmRNA in brain tissue of rats in various groups （n＝8，）

＊P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs model group.

IGF－1mRNA IGF－1RmRNA Sham op Group eration 0.179±0.038 0.257±0.045 Model 0.320±0.054＊ 0.453±0.064＊Experiment 0.425±0.062＊△ 0.537±0.066＊△

2.2 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R陽性細胞數 IGF－1和IGF－1R陽性細胞胞漿染色呈淺紅色或紅色。假手術組大鼠腦組織切片中見少量散在IGF－1和IGF－1R陽性細胞。實驗組和模型組大鼠腦組織切片中IGF－1和IGF－1R陽性細胞數高于假手術組（P＜0.05）。實驗組大鼠腦組織切片中IGF－1和IGF－1R陽性細胞數高于模型組（P＜0.05）。見表2和圖2（插頁六）。

圖1 各組大鼠腦組織中IGF－1（A）和IGF－1R（B）mRNA表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of IGF－1（A）and IGF－1R（B）mRNA in brain tissue of rats in various groups

表2 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R陽性細胞數Tab.2 Number of IGF－1and IGF－1Rpositive cells in brain tissue of rats in various groups （n＝8，）

表2 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R陽性細胞數Tab.2 Number of IGF－1and IGF－1Rpositive cells in brain tissue of rats in various groups （n＝8，）

＊P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs model group.

ositive cells Sham op Group No.of IGF－1 positive cells No.of IGF－1R p eration 13.24±2.94 12.52±3.45 Model 29.10±5.78＊ 34.54±6.35＊Experiment 41.28±8.52＊△ 56.41±9.28＊△

2.3 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白表達水平 假手術組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白呈低水平表達。實驗組和模型組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白表達水平高于假手術組（P＜0.05）。實驗組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白表達水平高于模型組（P＜0.05）。見表3和圖3。

表3 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of IGF－1and IGF－1Rproteins in brain tissue of rats in various groups （n＝8，）

表3 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of IGF－1and IGF－1Rproteins in brain tissue of rats in various groups （n＝8，）

＊P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs model group.

rotein Sham op Group IGF－1protein IGF－1Rp eration 0.17±0.03 0.12±0.04 Model 0.35±0.05＊ 0.54±0.06＊Experiment 0.71±0.09＊△ 0.68±0.08＊△

圖3 各組大鼠腦組織中IGF－1（A）和IGF－1R（B）蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of IGF－1（A）and IGF－1R（B）proteins in brain tissue of rats in various groups

3 討 論

IGF－1是一種活性蛋白多肽物質，幾乎可作用于所有的組織細胞［6］，其與受體IGF－1R結合后啟動胞內信號轉導，可促進細胞增殖分化，有效地抑制細胞程序性死亡。IGF－1系大腦發育所必需，在正常腦組織的生長發育中發揮重要作用；IGF－1與IGF－1R的結合可防止神經細胞凋亡、增加血管發生和神經發生等多種途徑減輕缺氧缺血對腦組織的損害［7－10］。IGF－1與IGF－1在正常腦組織有少量表達，而腦缺血損傷發生后，腦組織中IGF－1與IGF－1R表達水平即明顯增加［11］。本研究采用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，采用RT－PCR、免疫組織化學法和Western blotting法檢測大鼠缺血區腦組織中IGF－1和IGF－1R表達的結果顯示：在相應時間點各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA及蛋白表達趨勢一致，大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血區腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA及蛋白的表達明顯升高，提示缺血性損傷應激可促進腦組織中IGF－1和IGF－1R的生成。

注射用尤瑞克林（人尿激肽原酶）是從人尿液中提取精制的糖蛋白，有效成分為人尿激肽原酶，是激肽釋放酶－激肽系統的一個正向調節物質。腦組織缺血損傷后整個激肽釋放酶－激肽系統，包括激肽原酶、激肽均會一過性地升高，激肽受體表達也上調，表明激肽原酶－激肽系統參與腦缺血病理生理過程［12］。注射用尤瑞克林除了可以通過激肽途徑選擇性擴張缺血區域腦血管，增加局部血液灌注而發揮作用外，還可以抑制神經元和神經膠質細胞的凋亡過程，減少局部炎性細胞的浸潤，誘導神經干細胞（NSCs）的分化、遷移和成熟，增加局部血管的再生，促進側支血管的建立和開放［13－14］。動物腦缺血模型研究［15］表明：靜脈注射尤瑞克林對腦梗死、腦缺血再灌注損傷和急性腦缺血再灌注損傷恢復期動物均有改善作用，能顯著縮小腦梗死面積，改善神經癥狀并減少腦組織含水量。本實驗在大鼠腦缺血再灌注損傷模型的基礎上，應用尤瑞克林進行干預，結果顯示：實驗組大鼠缺血區腦組織中IGF－1和IGF－1R的mRNA和蛋白的表達高于模型組，提示尤瑞克林可進一步促進內源性IGF－1和IGF－1R的合成與表達。IGF－1和IGF－1R的表達上調，可調控下游信號通路，從而減輕缺血性腦損傷病情的發展，發揮神經保護作用。

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