RhoC慢病毒干擾載體的構建及其對卵巢癌SKOV3細胞中RhoC mRNA表達的影響

王 珂，鄒積艷，汪 麗，杜珍武，王俊容，葉 聰，潘 穎

（1.吉林大學中日聯誼醫院婦產科，吉林 長春 130033；2.吉林大學中日聯誼醫院研究生管理辦公室，吉林 長春 130033；3.吉林大學第二醫院中心實驗室，吉林 長春 130041）

卵巢癌嚴重威脅女性身體健康，是女性三大惡性腫瘤之一，其發病率位于第2位，而其病死率卻高居榜首。卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期患者的5年存活率約為20%［1－2］。卵巢癌的病因不明，發病機制復雜［3］，至今仍無特異性的指標可以用于卵巢癌的治療和判斷預后。近年來，腫瘤的基因治療成為熱點。國內外已有針對卵巢癌其他基因沉默的類似研究［4－5］，Clark等［6］研究首次明確并證實RhoC在腫瘤細胞轉移過程中起重要作用。以往研究多以質粒為載體，轉染效率低，本研究應用RNAi基因沉默技術，以卵巢癌SKOV3細胞為研究對象，將組織特異性的RhoC mRNA有效地導入細胞中，沉默卵巢癌SKOV3細胞中的致病基因RhoC，抑制RhoC基因與蛋白的表達，從而使卵巢癌的基因治療成為可能。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及儀器 人卵巢癌SKOV3細胞、人胚腎293T細胞均保存于吉林大學中日聯醫院中心實驗室。胎牛血清和DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司，丙酮酸鈉、非必需氨基酸和Trizol購自美國Invitrogen公司，Lenti－PacTM HIV慢病毒表達包裝試劑盒購自美國Gene Copoeia公司，兩步法實時熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司。Mx3000P熒光定量PCR儀購自美國Stratagene公司，PCR擴增儀購自美國ABI公司。

1.2 細胞培養 SKOV3細胞培養于含10% 胎牛血清的DMEM高糖培養基中。用于包裝慢病毒的人胚腎293T細胞培養于含10% 胎牛血清、1%丙酮酸鈉和1%非必需氨基酸混合液的DMEM高糖培養基中，上述2種細胞均置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。

1.3 RhoC基因RNA干擾慢病毒載體構建 根據人RhoC基因cDNA序列（GenBank NO：NM＿001042678.1）設計RNA干擾的靶序列，根據靶序列進行慢病毒載體構建。載體構建委托廣州復能基因生物技術有限公司完成。

1.4 慢病毒載體包裝 處于對數生長期的人胚腎293T細胞經消化重懸后，取1.5×106個細胞接種于培養皿，2d后將干擾RhoC質粒psiHIV－RhoC及陰性對照質粒psiHIV－NC分別按病毒包裝說明書進行包裝，收集24、48和72h時的上清液。經離心、過濾、濃縮后分裝，存放于－80℃條件下備用。所收集的病毒分別為Lenti－shRhoC和Lenti－NC。

1.5 細胞分組及處理 將SKOV3細胞按每孔1×105接種于6孔板，分別取1mL濃縮病毒LentishRhoC和通用陰性對照Lenti－NC感染SKOV3細胞。48h后，倒置熒光顯微鏡下觀察SKOV3細胞中綠色熒光蛋白表達。轉染Lenti－shRhoC的細胞為干擾組（2個亞平行組：psiHIV－RhoC1組和psiHIV－RhoC2組），轉染Lenti－NC的細胞為陰性對照組，未進行轉染操作的細胞為空白對照組（SKOV3組）。

1.6 RT－PCR法檢測 SKOV3細胞中RhoC mRNA的表達 采用Trizol試劑分別提取干擾組、陰性對照組和空白對照組SKOV3細胞中RhoC基因的總RNA，用逆轉錄試劑盒將RNA轉化為cDNA，然后采用ABI7500fast熒光定量PCR儀進行擴增。按照兩步法實時熒光定量試劑盒SYBR PrimeScript RT－PCR Kit說明書進行。PCR引物：RhoC基因上游引物，5′－ACCTGCCTCCTCATCGTCTTC－3′；下游引物，5′－CACCTGCTTGCCGTCCACC－3′；PCR產物片段長度為105bp。GAPDH 內參基因上游引物，5′－TGCACCACCAACTGCTTAGC－3′；下游引物，5′－GGCATGGACTGTGGTCATGAG－3′；PCR 產物片段長度為87bp。PCR反應體系20μL，反應條件：95℃、30s，95℃、5s，60℃、30s，共40個循環；95℃、15s，60℃、60s，95℃、15s。RhoC mRNA的表達水平以2－ΔΔct法計算。

1.7 統計學分析 采用SPSS 11.5統計軟件進行統計學分析。各組SKOV3細胞中RhoC－mRNA相對表達量以表示，組間均數比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 RhoC基因RNA干擾慢病毒載體構建 根據RhoC基因cDNA序列應用RNA干擾設計軟件，設定RhoC基因干擾靶向序列為2條，第1條的序列為GACCTGCCTCCTCATCGTC，該序列起始點位于RhoC基因cDNA核苷酸序列的第387位核苷酸；第二條的序列為CGAACCGGATCAGTGC－CTT，該序列起始點位于RhoC基因cDNA核苷酸序列的第776位核苷酸；上述序列分別克隆入慢病毒 psiHIV－H1載體（圖1），分別命名為psiHIV－RhoC1與psiHIV－RhoC2。

圖1 psiHIV－H1載體構建圖Fig.1 Diagram of construction of psiHIV－H1vector

2.2 包裝慢病毒載體感染SKOV3細胞形態學陰性對照組SKOV3細胞按預期可見綠色熒光蛋白表達。經病毒感染的psiHIV－RhoC1和psiHIVRhoC2組SKOV3細胞中亦可見綠色熒光蛋白的表達，表明Lenti－shRhoC慢病毒包裝成功，并能作為干擾載體整合于靶細胞SKOV3的基因組，而空白對照組SKOV3細胞中未見綠色熒光蛋白表達。見圖2（插頁四）。

2.3 各組SKOV3細胞中RhoC mRNA表達水平psiHIV－RhoC1組SKOV3細胞中RhoC mRNA表達水平（0.006）比空白對照組（1.000）降低，psiHIV－RhoC2組SKOV3細胞中RhoC－mRNA表達水平（0.040）比空白對照組降低。見圖3（插頁五）。

3 討 論

RhoC是Rho基因家族中的一員，能夠參與腫瘤細胞多項重要的生命活動，如調節肌動蛋白骨架、參與細胞信號轉導和細胞增殖等。其在惡性腫瘤中的高表達與腫瘤的遷移和侵襲有密切關聯［7－8］。siRNA的生成是RNAi技術的關鍵點。體外制備轉染效率雖然高，但是極易降解，難以長期發揮干擾作用。目前常用質粒作為載體［9－11］，雖然克服了易降解的缺點，但是轉染效率卻不盡如人意。所以本實驗選用了近年來新興的載體—慢病毒，其不易降解，同時轉染效率較質粒高，能夠穩定地在細胞中發揮作用，且能作用于哺乳動物，感染分裂細胞和非分裂細胞，激發外源基因的表達，是基因治療比較理想的工具。

本研究采用慢病毒作為載體通過RNA干擾技術建立了RhoC基因穩定低表達的卵巢癌SKOV3細胞株，轉染psiHIV－Rhoc的SKOV3細胞中RhoC mRNA的表達水平較空白對照組顯著降低，這使得卵巢癌的基因治療更具可能性。

綜上所述，本研究通過包裝慢病毒LentishRhoC，建立了慢病毒介導的RhoC基因穩定沉默卵巢癌SKOV3細胞株，通過實時熒光定量PCR法，證實構建的慢病毒載體能夠高效地阻斷卵巢癌SKOV3細胞中致病基因RhoC mRNA的表達，為卵巢癌基因治療的進一步研究奠定了基礎。

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