白藜蘆醇對喉癌Hep－2細(xì)胞順鉑敏感性的增強(qiáng)作用及其機(jī)制

戰(zhàn)仕花，王 蘋，尹萬忠，祝 威

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科，吉林 長春 130021）

目前順鉑（cisplatin，DDP）已經(jīng)應(yīng)用于多種腫瘤的一線聯(lián)合化療方案中，但其具有腎毒性、消化道毒性、骨髓抑制和耳毒性等不良反應(yīng)［1］，因此其用量及聯(lián)合配伍受到限制。白藜蘆醇（resveratrol，Res）具有抗腫瘤、抗炎、肝臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性，其中最具研究前景的是其抗腫瘤效應(yīng)［2］。目前研究［3－6］顯示：白藜蘆醇具有激活sirtuin，降低DDP引起的腎毒性、耳毒性和心臟損傷等的作用。沉默信息調(diào)節(jié)因子2（silent information regulator 2，Sir2）相關(guān)酶1（Sirt1）是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotin－amide adenine dinucleotide，NAD）的去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），Sirt1與多種細(xì)胞生物學(xué)功能有關(guān)聯(lián)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用［7］。sirtuins是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的Sir2的同源物，其中Sirt1是研究較深入的一個成員。Sirt1以許多非組蛋白和組蛋白為底物，與多種細(xì)胞生物學(xué)功能如基因轉(zhuǎn)錄沉默、細(xì)胞生長周期調(diào)節(jié)等有密切關(guān)聯(lián)，Sirt1作為治療不同疾病的靶點(diǎn)逐漸被人們重視，Sirt1不僅參與了其壽命的調(diào)節(jié)，而且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有非常重要的作用［8］。但在許多腫瘤細(xì)胞中其作用仍存在爭議。Sirt1在多種惡性腫瘤中存在過表達(dá)的情況，作為腫瘤促進(jìn)因子［9］。Sirt1在部分惡性腫瘤如膠質(zhì)母胞瘤中表達(dá)水平有所降低［10］。Wang等［11］發(fā)現(xiàn)：Sirt1的表達(dá)水平在許多其他類型腫瘤中降低，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膀胱癌前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和肝癌等，Sirt1在這些組織中起腫瘤抑制因子作用而非腫瘤促進(jìn)因子的作用。有研究［12］顯示：白藜蘆醇增加卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，目前尚未有研究將白藜蘆醇和DDP聯(lián)合應(yīng)用于喉癌細(xì)胞。本實(shí)驗擬采用白藜蘆醇聯(lián)合DDP作用于喉癌細(xì)胞，觀察白藜蘆醇對DDP化療的增敏作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep－2細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶（美國Gibco公司），Triton X－100、白藜蘆醇、DDP（美國Sigma公司），sirtinol（美國Cayman公司），Sirt1多克隆抗體（北京博奧森公司），CCK－8、Annexin VFITC Kit（碧云天生物研究所）。超凈工作臺JDJ－203（蘇州凈化設(shè)備廠），CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），BX50熒光顯微鏡、FV1000型激光共聚焦熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組人喉鱗狀細(xì)胞癌 Hep－2細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100U·mL－1的青霉素和100U·L－1的鏈霉素1640培養(yǎng)基中，在飽和溫度、37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。當(dāng)細(xì)胞生長處于對數(shù)生長期時，將細(xì)胞接種于96孔板、9.6cm2小皿和圓形載玻片。細(xì)胞分為空白對照組和DDP組（3、6、12和24μmol·L－1），選出DDP的最佳濃度用于以下分組。對照組、DDP組、白藜蘆醇組、sirtinol組、白藜蘆醇＋sirtinol組、白藜蘆醇＋DDP組、sirtinol＋DDP組、白藜蘆醇＋sirtinol＋DDP組。白藜蘆醇＋sirtinol組細(xì)胞加藥時先加白藜蘆醇，1h后加DDP；白藜蘆醇＋DDP組和sirtinol＋DDP組細(xì)胞加藥時先加白藜蘆醇或sirtinol，1h后加DDP；白藜蘆醇＋sirtinol＋DDP組加藥時先加白藜蘆醇，1h后加sirtinol，再過1h后加DDP。最終藥物的作用濃度為：白藜蘆醇50μmol·L－1，sirtinol 40 μmol· L－1，DDP 6μmol·L－1。

1.3 CCK－8法檢測細(xì)胞生存率 選對數(shù)生長期細(xì)胞用胰酶消化后，鋪于96孔板內(nèi)，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h至細(xì)胞密度為80%后加藥；CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；在超凈臺中將96孔板中培養(yǎng)基換為不含血清及抗生素的1640培養(yǎng)基100μL，然后加入CCK－8試劑10μL；37℃孵育2h；在酶標(biāo)儀450nm處檢測吸光度（A）值，計算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率＝（實(shí)驗組A值－空白組A值）／（對照組A值－空白組A值）×100%。

1.4 免疫熒光法檢測細(xì)胞中Sirt1蛋白表達(dá) 選對數(shù)生長期細(xì)胞用胰酶消化后，鋪于圓形載玻片并標(biāo)記，待細(xì)胞密度達(dá)40%時加藥。室溫下4%多聚甲醛溶液固定30min，PBS漂洗3次，每次5min；加入1%Triton X－1001.5mL打孔10min后，PBS漂洗3次，每次5min；滴加5%山羊血清，于室溫下放置1h；加入Sirt1抗體（1∶100），4℃孵育過夜；0.1mol·L－1PBS在搖床上漂洗3次，加入Alexa 488綠色山羊抗兔抗體（1∶200稀釋），室溫避光靜置1h；0.1mol·L－1PBS漂洗3次，每次5min；90%甘油封片，熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，拍照。圖像中的綠色熒光顯示Sirt1蛋白表達(dá)陽性，隨機(jī)取3個視野用激光共聚焦熒光顯微鏡檢測平均熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度越強(qiáng)提示Sirt1蛋白表達(dá)越多。

1.5 Annexin V－FITC Kit法檢測細(xì)胞凋亡率 選對數(shù)生長期細(xì)胞用胰酶消化后，鋪于小皿中并標(biāo)記，待細(xì)胞密度達(dá)80%時加藥。加藥培養(yǎng)步驟同CCK－8中的加藥步驟。移去培養(yǎng)基后用 Hank’s液洗滌；查細(xì)胞數(shù)，胰酶消化；加1×binding Buffer 1mL，300g離心10min，移去上清，加入1×binding Buffer 100μL重懸細(xì)胞；加10μL Annextin V－FITC，混勻后室溫下孵育15min；加1×binding Buffer 1mL，300g離心10min，移去上清。加入1×binding Buffer 500μL重懸細(xì)胞；加入5μL PI solution立即進(jìn)行鋪片，應(yīng)用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，拍照。綠色熒光顯示早期的細(xì)胞凋亡，紅色熒光顯示晚期的凋亡和壞死細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率＝同一視野下凋亡細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graphpad Prism統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。細(xì)胞生存率、平均免疫熒光強(qiáng)度和細(xì)胞凋亡率以表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組Hep－2細(xì)胞的生存率 CCK－8法檢測6、12、24和48h各組Hep－2細(xì)胞生存率，與空白對照組比 較，12、24和48h 時，6、12、24μmol·L－1DDP組細(xì)胞生存率明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），見表1。CCK－8檢測細(xì)胞生存率，與對照組比較，DDP組（78.42%）、白藜蘆醇組（87.35%）、白藜蘆醇＋DDP組（69.53%）、sirtinol＋DDP組（86.77%）和白藜蘆醇＋sitinol＋DDP組（81.69%）細(xì)胞生存率明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。與DDP組比較，白藜蘆醇＋DDP組細(xì)胞生存率明顯下降（P＜0.01）。與白藜蘆醇＋DDP組比較，白藜蘆醇＋sirtinol＋DDP組細(xì)胞生存率明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表1 不同時間點(diǎn)和DDP濃度各組Hep－2細(xì)胞生存率Tab.1 Survival rates of Hep－2cells in various groups treated with different concentrations of DDP at different time points（n＝3，，η／%）

表1 不同時間點(diǎn)和DDP濃度各組Hep－2細(xì)胞生存率Tab.1 Survival rates of Hep－2cells in various groups treated with different concentrations of DDP at different time points（n＝3，，η／%）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01compared with blank control group.

6 12 24 48 Blank control 100.00±0.00 100.00±0.00 100.0 Group Survival rate（t／h）0±0.00 100.00±0.00 DDP（μmol·L－1）3 98.81±2.06 98.38±2.70 98.58±7.40 92.48±5.76 100.24±1.81 92.08±0.39＊ 89.08±4.30＊＊ 80.28±2.2＊＊12 97.63±2.34 85.61±1.20＊＊ 82.42±7.07＊＊ 82.97±1.45＊＊24 97.75±2.28 80.77±5.15＊＊ 59.87±4.95＊＊ 47.60±5.15＊＊

2.2 各組Hep－2細(xì)胞中Sirt1蛋白表達(dá)強(qiáng)度 與對照組比較，白藜蘆醇組、DDP組和白藜蘆醇＋DDP組細(xì)胞中Sirt1蛋白平均免疫熒光強(qiáng)度均明顯升高（P＜0.01）。與白藜蘆醇＋sirtinol組比較，白藜蘆醇組細(xì)胞中Sirt1蛋白平均免疫熒光強(qiáng)度明顯升高（P＜0.01）。與sirtinol＋DDP組比較，DDP組細(xì)胞中Sirt1蛋白平均免疫熒光強(qiáng)度明顯升高（P＜0.01）。與 DDP組比較，白藜蘆醇＋DDP組細(xì)胞中Sirt1蛋白平均免疫熒光強(qiáng)度明顯升高（P＜0.01）。與白藜蘆醇＋sirtinol＋DDP組比較，白藜蘆醇＋DDP組細(xì)胞中Sirt1蛋白平均免疫熒光強(qiáng)度明顯升高（P＜0.01）。見圖1（插頁三）和表3。

表2 各組Hep－2細(xì)胞生存率Tab.2 Survival rates of Hep－2cells in various groups（n＝3，，η／%）

表2 各組Hep－2細(xì)胞生存率Tab.2 Survival rates of Hep－2cells in various groups（n＝3，，η／%）

＊P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs DDP group；#P＜0.05 vs sirtinol＋DDP group.

Group Survival rate Control 100.00±0.00 DDP 78.42±1.35＊Resveratrol 87.35±1.25＊Resveratrol＋DDP 69.53±0.45＊△Sirtinol＋DDP 86.77±1.76＊Resveratrol＋sirtinol＋DDP 81.69±6.33＊#

表3 各組Hep－2細(xì)胞中Sirt1蛋白的平均免疫熒光強(qiáng)度Tab.3 Mean fluorescence intensities of Sirt1protein in Hep－2cells in various groups （n＝3，）

表3 各組Hep－2細(xì)胞中Sirt1蛋白的平均免疫熒光強(qiáng)度Tab.3 Mean fluorescence intensities of Sirt1protein in Hep－2cells in various groups （n＝3，）

＊P＜0.01compared with control group；△P＜0.01compared with DDP group；#P＜0.01compared with resveratrol group；▲P＜0.01compared with resveratrol＋DDP group.

Group Mean fluorescence intensit y Control 103.73±10.65 DDP 134.30±12.65＊Resveratrol 200.67±21.35＊Resveratrol＋DDP 169.90±14.93＊△#Sirtinol 87.07±4.93 Sirtinol＋DDP 111.43±5.61△Resveratrol＋sirtinol 108.07±5.34#Resveratrol＋sirtinol＋DDP 127.70±13.37##▲

2.3 各組細(xì)胞凋亡率 與對照組（4.39%±0.65%）比較，白藜蘆醇＋DDP組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。與DDP組（12.89% ±0.56%）比較，白藜蘆醇＋DDP組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。與白藜蘆醇組比較，白藜蘆醇＋DDP組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。與白藜蘆醇＋DDP＋sirtinol組（12.37%±0.99%）比較，白藜蘆醇＋DDP組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。見圖2（插頁三）。

3 討 論

臨床上喉癌的化療以應(yīng)用DDP為主，本研究中CCK－8實(shí)驗的檢測結(jié)果也提示DDP可抑制Hep－2細(xì)胞的生長，促進(jìn) Hep－2細(xì)胞的凋亡。DDP在抗腫瘤作用的同時，同樣表現(xiàn)出腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性和骨髓抑制的不良反應(yīng)［1］。Lee等［13］研究發(fā)現(xiàn)：DDP與耳蝸組織結(jié)合后可激發(fā)產(chǎn)生大量的自由基，諸如超氧化物、過氧化氫等，進(jìn)而引起內(nèi)耳損傷。王黎等［14］研究發(fā)現(xiàn)：DDP引起腎毒性的發(fā)病機(jī)制主要與氧化應(yīng)激機(jī)制有關(guān)聯(lián)。DDP的毒性限制其在臨床化療中的應(yīng)用，針對降低DDP毒性作用的聯(lián)合化療方案仍有待開發(fā)。

白藜蘆醇是一種廣泛存在于葡萄、虎杖和花生等多種植物中的多酚化合物，是植物為抵抗外界刺激如紫外線、真菌、病毒感染或機(jī)械損傷而產(chǎn)生的一種植物抗毒素。白藜蘆醇具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等抗腫瘤作用，也有抗心血管疾病、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗衰老等生物學(xué)作用。在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌和白血病等多種腫瘤細(xì)胞中白藜蘆醇均有顯著抑制腫瘤的作用［15］。白藜蘆醇有抗腫瘤作用，可減少DDP引起的大鼠心臟毒性、內(nèi)耳損傷和腎毒性［4－6］。Bj?rklund等［16－18］研究發(fā)現(xiàn)：白藜蘆醇也能提高卵巢上皮癌細(xì)胞對順鉑的敏感度。本研究結(jié)果顯示：白藜蘆醇可抑制喉癌Hep－2細(xì)胞生長，促進(jìn)喉癌Hep－2細(xì)胞凋亡。

Sirt1是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶，白藜蘆醇具有激活Sirt1的作用［3］。Sirt1以組蛋白和非組蛋白為底物進(jìn)行去乙酰化，參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能如基因轉(zhuǎn)錄沉默、細(xì)胞生長周期調(diào)節(jié)等。本研究中細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示：喉癌Hep－2細(xì)胞中表達(dá)Sirt1蛋白，白藜蘆醇作用后Hep－2細(xì)胞中Sirt1蛋白過表達(dá)，DDP也能提高喉癌Hep－2細(xì)胞中Sirt1蛋白的表達(dá)，白藜蘆醇和DDP聯(lián)合應(yīng)用后Hep－2細(xì)胞中Sirt1蛋白過表達(dá)。DDP和白藜蘆醇抑制Hep－2細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡作用可能部分是由Sirt1蛋白表達(dá)增加引起。

綜上所述，DDP在抗腫瘤作用的同時，表現(xiàn)出的腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性、心臟毒性和骨髓抑制等不良反應(yīng)限制其臨床應(yīng)用。本研究結(jié)果顯示：與單獨(dú)使用DDP比較，白藜蘆醇與DDP聯(lián)合作用時Hep－2細(xì)胞生長明顯被抑制，細(xì)胞凋亡明顯增加，提示白藜蘆醇增加了Hep－2細(xì)胞對DDP的敏感性，其機(jī)制可能與白藜蘆醇提高Hep－2細(xì)胞中Sirt1蛋白表達(dá)，導(dǎo)致Hep－2細(xì)胞對DDP的敏感性增加有關(guān)。本研究可能為喉癌的化療提供新思路、新線索和新方法。

［1］張笑辰，張麗錦，鄒 蘊(yùn)，等 .順鉑及順鉑載體的研究進(jìn)展 ［J］.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2011，18（22）：25－27.

［2］Delmas D，Solary E，Latruffe N.Resveratrol，a phytochemical inducer of multiple cell death pathways：apoptosis，autophagy and mitotic catastrophe［J］.Curr Med Chem，2011，18（8）：1100－1121.

［3］Wang W，Yan C，Zhang J，et al.SIRT1inhibits TNF－α induced apoptosis of vascular adventitial fibroblasts partly through the deacetylation of FoxO1 ［J］.Apoptosis，2013，8（6）：689－701.

［4］Wang J，He D，Zhang Q，et al.Resveratrol protects against cisplatin－induced cardiotoxicity by alleviating oxidative damage［J］.Cancer Biother Radiopharm，2009，24（6）：675－680.

［5］?imζek G，Tokgoz S，Vuralkan E，et al.Protective effects of resveratrol on cisplatin－dependent inner－ear damage in rats ［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2013，270（6）：1789－1793.

［6］Kim D，Jung Y，Lee J，et al.SIRT1activation by resveratrol ameliorates cisplatin－induced renal injury through deacetylation of p53 ［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2011，301（2）：F427－F435.

［7］Imai S.The NAD world：a new systemic regulatory network for metabolism and aging－Sirt1，systemic NAD biosynthesis，and their importance ［J］.Cell Biochem Biophys，2009，53（2）：65－74.

［8］羅 蘭，高政南，程麗靜，等.Sirt與基因轉(zhuǎn)錄 ［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2007，23（3）：187－193.

［9］Jung－Hynes B，Nihal M，Zhong W，et al.Role of sirtuin histone deacetylase SIRT1in prostate cancer.A target for prostate cancer management via its inhibition？ ［J］.J Biol Chem，2009，284（6）：3823－3832.

［10］Li K，Luo J.The role of SIRT1in tumorigenesis［J］.N Am J Med Sci，2011，4（2）：104－106.

［11］Wang R，Sengupta K，Li C，et al.Impaired DNA damage response，genome instability，and tumorigenesis in SIRT1 mutant mice ［J］.Cancer Cell，2008，14（4）：312－323.

［12］Nessa MU，Beale P，Chan C，et al.Combinations of resveratrol，cisplatin and oxaliplatin applied to human ovarian cancer cells ［J］.Anticancer Res，2012，32（1）：53－59.

［13］Lee JE，Nakagawa T，Kim TS，et al.Role of reactive radicals in degeneration of the auditory system of mice following cisplatin treatment ［J］.Acta Otolaryngol，2004，124（10）：1131－1135.

［14］王 黎，裴 瑞，楊紅梅，等.順鉑誘導(dǎo)腎損傷過程中腎皮質(zhì)脂質(zhì)過氧化的變化 ［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2004，20（4）：393－395.

［15］黎永勝，文 軍.白藜蘆醇的藥理作用研究進(jìn)展 ［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（3）：469－471.

［16］Bj?rklund M，Roos J，Gogvadze V，et al.Resveratrol induces SIRT1－and energy－stress－independent inhibition of tumor cell regrowth after low－dose platinum treatment ［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2011，68（6）：1459－1467.

［17］馮獻(xiàn)斌，馮馭臣，沈永奇.中藥熱敷聯(lián)合谷胱甘肽防治含順鉑方案化療所致周圍神經(jīng)毒性研究 ［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，30（6）：1120－1122.

［18］蘆殿榮，蘆殿香，殷玉琨，等.順鉑導(dǎo)致化療相關(guān)惡心嘔吐反應(yīng)的中藥防治 ［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，30（4）：645－647.