p－Tau蛋白在抑郁癥大鼠海馬組織中的表達

隋竹欣，李 珍，劉 昊，袁 楊，王海濤

（1.河北聯合大學基礎醫學院組織胚胎學系，河北 唐山 063000；2.山東萬杰醫學院醫學系，山東 淄博 255000；河北聯合大學附屬醫院神經內科，河北 唐山 063000）

世界衛生組織調查［1］表明：至2020年，抑郁癥將會成為最重要的引起人類殘疾的疾病。近年研究［2］顯示：抑郁癥患者海馬部位的神經元存在可塑性變化，海馬參與情緒的控制和反應，對情緒反應起非特異性抑制作用，是極其重要的情緒整合區。微管相關蛋白Tau是一種大腦磷酸化蛋白質，在神經系統的發育和維持微管功能方面有重要作用，多種神經系統疾病均出現了與Tau蛋白相關的特征性病理改變，Tau蛋白的過度磷酸化參與了多種神經退行性疾病的發生過程［3］，其在抑郁癥發病過程中的作用尚未見詳細報道。本研究建立了大鼠抑郁癥模型，對大鼠進行行為學檢測，尼氏染色觀察造模前后大鼠海馬神經元形態變化，Western blotting法檢測磷酸化Tau（p－Tau）蛋白在不同時間點的表達水平，初步探討抑郁癥發病過程中海馬體積異常的原因，為進一步研究抑郁癥的發病機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 健康成年雄性SD大鼠40只，體質量160～180g（河北聯合大學實驗動物中心提供，動物合格證編號：SCXK京2009－0004），適應性飼養7d后用于實驗。飼養條件：22℃～25℃、晝夜節律（12h／12h）、自由飲水進食。p－Tau兔多克隆抗體、β－actin小鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，免疫印跡相關試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組及模型建立 將40只大鼠隨機分為對照組和模型組，每組20只。模型組大鼠給予慢性不可預見性溫和刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）建立模型。刺激包括11種：行為限制24h、鼠籠45℃傾斜24h、潮濕墊料24h、4℃冰水游泳5min、禁食24h、42℃熱水游泳5min、禁水24h、雙耳電擊5s2次（0.8mA）、夾尾1min、鼠籠搖動15min和持續光照24h。以上11種應激隨機分配，每天給予大鼠1種應激，同種應激不連續出現，共計2輪。對照組大鼠除每天抓取1次外，不做特殊處理。在應激結束后分別于1、7、14和28d處死大鼠用于實驗，對照組大鼠處死時間和模型組相同。

1.3 大鼠行為學檢測 ① 糖水偏好實驗：禁水禁食24h后，每籠放置2個完全相同水瓶，1%糖水和純凈水各200mL雙瓶共飲，測量1h內糖水和普通水消耗量，計算大鼠的糖水偏好率：糖水偏好率＝糖水消耗量／總液體消耗量×100%；② 曠場實驗：實驗時每次將1只大鼠放入曠場中心方格內，通過動物行為學實驗視頻分析系統進行測試，測試內容包括行走總路程、中央活動時間、站立次數和修飾行為次數；③ Morris水迷宮實驗：連續測試3d，每天6個循環，記錄在60s內尋找水平面下平臺的時間，即逃避潛伏期。取3d測試成績計為其空間記憶成績。

1.4 尼氏染色觀察大鼠海馬神經元形態 模型組大鼠應激結束后第1天進行取材，將大鼠腦組織冠狀切面石蠟包埋，4μm切片，切片脫蠟至水，用尼氏染料浸染20～30min，充分水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，觀察大鼠海馬神經元形態學變化。

1.5 Western blotting法檢測大鼠海馬組織中p－Tau蛋白表達水平 將大鼠直接斷頭取腦，冰上迅速分離海馬，用蛋白裂解液和酶抑制劑提取組織總蛋白。通過BCA定量后按照40μg蛋白量上樣進行10聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳，之后進行電轉至PVDF膜，5%BSA封閉2h，一抗p－MAP2兔多克隆抗體（1∶1000）4℃冰箱孵育過夜，羊抗兔二抗IgG（1∶5000）室溫孵育2h，ECL顯色。內參照β－actin用同樣方法進行Western blotting分析。以目的條帶與內參照的吸光度（A）比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.6 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計學分析。2組大鼠糖水偏好實驗、曠場試驗和Morris水迷宮實驗結果以表示，組間比較采用t檢驗；不同時間點大鼠海馬p－Tau蛋白表達水平以表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結 果

2.1 糖水偏好實驗 與對照組比較，模型組大鼠普通水消耗量無明顯變化（P＞0.05），糖水消耗量和糖水偏好百分比明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 2組大鼠糖水偏好實驗結果Tab.1 Results of sucrose preference test of rats in two group （n＝20，）

表1 2組大鼠糖水偏好實驗結果Tab.1 Results of sucrose preference test of rats in two group （n＝20，）

＊P＜0.01 vs control group.

Group Water consumption（V／mL）Sucrose consumption（V／mL）Percentage of sucrose preference（η／%）Control 16.60±2.0742.80±8.2271.20±5.26 Model 18.81±2.3828.00±3.16＊59.00±2.82＊

2.2 曠場實驗和水迷宮實驗 與對照組比較，模型組大鼠行走總路程、中央活動時間、直立次數和修飾行為次數減少（P＜0.01），平均逃避潛伏期明顯延長（P＜0.01）。見表2和圖1。

表2 2組大鼠曠場實驗和Morris水迷宮實驗結果Tab.2 Results of open field test and Morris water maze of rats in two groups （n＝20，）

表2 2組大鼠曠場實驗和Morris水迷宮實驗結果Tab.2 Results of open field test and Morris water maze of rats in two groups （n＝20，）

＊P＜0.01 vs control group.

Group Overall walking distance（l／m）Central activity time（t／s）Up－right times Grooming behavior Average escape latent period（t／s）Control 62.02±7.66 30.70±6.21 18.40±2.36 12.20±1.68 8.99±1.28 Model 41.62±5.11＊ 16.90±4.17＊ 10.20±2.65＊ 6.00±1.88＊ 21.53±2.58＊

圖1 2組大鼠曠場實驗和Morris水迷宮實驗軌跡圖Fig.1 Locus diagram of open field test and Morris water maze of rats in two groups

2.3 大鼠海馬細胞形態學 尼氏染色，對照組大鼠海馬細胞密度大，錐體細胞層厚，排列親密整齊，胞體飽滿，突起明顯。模型組大鼠海馬細胞密度小，錐體細胞層變薄，細胞間隙大，排列疏松，細胞核萎縮，突起減少。見圖2（插頁二）。

2.4 各組大鼠海馬組織中p－Tau蛋白表達水平對照組大鼠海馬組織中p－Tau蛋白表達水平為（0.50±0.01），模型組大鼠1、7、14和28d海馬組織中p－Tau蛋白表達水平分別為0.20±0.01、0.77±0.01、1.20±0.04和0.68±0.04。模型組大鼠CUMS后1d，海馬組織中p－Tau蛋白表達水平表達低于對照組（P＜0.01）；7d后開始高于對照組（P＜0.05）；14d明顯高于對照組（P＜0.01）；28d仍略高于對照組（P＜0.05）。各組大鼠海馬組織中p－Tau蛋白表達見圖3。

圖3 2組大鼠海馬組織中p－Tau蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of p－Tau protein in hippocampus tissue of rats in two groups

3 討 論

抑郁癥發病率高，發病年齡寬泛，已嚴重影響人們的身心健康。動物模型的成功建立促進了抑郁癥的基礎研究。本研究結果表明：應激后大鼠的糖水消耗量和糖水偏好百分比低于對照組，模型組大鼠CUMS后表現出明顯的 “快感缺失”癥狀；曠場實驗結果表明：應激后大鼠在新異環境中自主行為、探究行為明顯減少；Morris水迷宮實驗結果表明：大鼠空間記憶力減退。由此可見CUMS能使大鼠出現愉快感減退，自主探究減少，精神意志運動遲滯等抑郁癥狀，可以應用于抑郁癥的基礎研究。這與本課題組前期研究［4］結果一致。

既往研究顯示：不論是抑郁癥動物模型［5］還是抑郁癥患者［6－10］，均表現出海馬結構的異常變化。本研究結果提示應激后大鼠海馬神經元形態發生改變。海馬參與情緒的控制和反應，是極其重要的情緒整合區。近年研究［11－12］顯示：抑郁癥患者海馬部位的神經元存在可塑性變化，海馬神經可塑性改變是抑郁癥的病理生理學特點之一。Tau蛋白是一種含磷糖蛋白，主要分布在中樞神經系統的神經元軸突和胞漿內，參與維持細胞形態、細胞內物質轉運和細胞有絲分裂等過程，其磷酸化程度與神經元的可塑性有關［13］。當Tau蛋白發生高度磷酸化時，可破壞Tau蛋白同微管的結合能力，從而影響細胞骨架系統的穩態［14］。研究［15］表明：在神經退行性疾病中神經細胞凋亡增強與Tau蛋白異常磷酸化有密切的關系。為研究抑郁癥發病中海馬神經細胞是否存在Tau蛋白磷酸化異常，本實驗采用免疫印跡方法檢測抑郁癥大鼠海馬組織中p－Tau表達水平結果顯示：大鼠海馬組織中p－Tau蛋白表達水平在應激結束后1d顯著低于對照組，而7d后高于對照組，14d達到高峰，28d回落但依舊高于對照組，提示應激可以導致Tau蛋白磷酸化增高。p－Tau蛋白影響神經細胞的骨架系統，導致細胞損傷死亡，這可能是導致海馬神經元萎縮的原因之一。本課題組前期研究［16］結果證實：抑郁癥大鼠海馬神經細胞凋亡增加，可能與Tau蛋白磷酸化增高有關。本研究結果顯示：應激后1d，大鼠海馬p－Tau蛋白表達水平降低，但很快就表現出升高，其詳細機制有待深入研究探討。

綜上所述，抑郁癥大鼠海馬結構異常可能與Tau蛋白磷酸化異常有關，其具體機制在后期的工作中有待于進一步深入研究。

［1］Duman RS，Kehne JH.Depression ［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets，2007，6（2）：85－86.

［2］許委娟，許 毅.抑郁癥與神經可塑性 ［J］.國際精神病學雜志，2011，38（3）：184－187.

［3］Spires－Jones TL，Stoothoff WH，de Calignon A，et al.Tau pathophysiology in neurodegeneration：a tangled issue ［J］.Trends Neurosci，2009，32（3）：150－159.

［4］王海濤，劉 昊，徐愛軍，等.氟西汀對抑郁癥大鼠杏仁核磷酸化微管相關蛋白2表達的影響 ［J］.吉林大學學報：醫學版，2012，38（4）：713－716.

［5］Ahdidan J，Hviid LB，Chakravarty MM，et al.Longitudinal MR study of brain structure and hippocampus volume in major depressive disorder ［J］.Acta Psychiatr Scand，2011，123（3）：211－219.

［6］Amico F，Meisenzahl E，Koutsouleris N，et al.Structural MRI correlates for vulnerability and resilience to major depressive disorder ［J］.J Psychiatry Neurosci，2011，36（1）：15－22.

［7］Malykhin NV，Carter R，Seres P，et al.Structural changes in the hippocampus in major depressive disorder：contributions of disease and treatment ［J］.J Psychiatry Neurosci，2010，35（5）：337－343.

［8］Zannas AS，McQuoid DR，Payne ME，et al.Negative life stress and longitudinal hippocampal volume changes in older adults with and without depression ［J］.J Psychiatr Res，2013，47（6）：829－834.

［9］Jayatissa MN，Henningsen K，Nikolajsen G，et al.A reduced number of hippocampal granule cells does not associated with an anhedonia－like phenotype in a rat chronic mild stress model of depression ［J］.Stress，2010，13（2）：95－105.

［10］張曉玲，孫 彥，張 鑫，等.首發抑郁癥患者海馬容積的研究 ［J］.西安交通大學學報：醫學版，2012，33（2）：647－650.

［11］Czeh B，Simon M，Schmelting B，et al.Astroglial plasticity in the hippocampus is affected by chronic psychosocial stress and concomitant fluoxetine treatment ［J］.Neuropsychopharmacology，2006，31（8）：1616－1626.

［12］Pittenger C，Duman RS.Stress，depression，and neuroplasticity：a convergence of mechanisms ［J］.Neuropsychopharmacology，2008，33（1）：88－109.

［13］楊江勇，顧建蘭，施建華，等.O－GlcNAc糖基轉移酶（OGT）基因表達的抑制對tau蛋白磷酸化作用的影響 ［J］.生物化學與生物物理進展，2009，36（3）：346－352.

［14］王景方，伊紅麗，袁曉玲，等.白藜蘆醇對AD大鼠學習記憶能力和海馬P－tau表達的影響 ［J］.中風與神經疾病雜志，2014，31（1）：22－25.

［15］魯遠君，余昌胤.雷公藤多甙對慢性腦低灌注大鼠海馬CA1區血管內皮生長因子和磷酸化tau蛋白表達的影響 ［J］.臨床神經病學雜志，2010，23（2）：117－120.

［16］劉 昊，王海濤，徐愛軍，等.抑郁癥模型大鼠海馬神經元自噬變化及其機制 ［J］.吉林大學學報：醫學版，2013，39（4）：672－675.