硫化氫對糖尿病大鼠心肌組織中MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達及心肌纖維化的影響及其機制

褚 春，曾 歐，羅 健，李 芳，肖 婷，周松柏，楊 軍

（1.南華大學附屬第二醫院藥劑科，湖南 衡陽421001，2.南華大學附屬第一醫院心血管內科，湖南 衡陽 421001）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DC）作為糖尿病（diabetes melltus，DM）一種獨立心血管并發癥，目前日益受到重視，但其發病機制十分復雜，至今仍未完全闡明。有研究［1］顯示：DC的發生發展與心肌纖維化有密切關聯。目前研究［2］顯示：DM心肌纖維化的發生機制與基質金屬蛋白酶（MMPs）／基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs）的調控紊亂有關聯，但其中內在機制目前尚不清楚。膜型基質金屬蛋白酶1（membranetype 1matrixmetallo－proteinase，MT1－MMP）是基質金屬蛋白酶家族的新成員，可降解各種細胞間質大分子，活化proMMP－2和MMP－13促進細胞遷移等［3－6］。MT1－MMP作為一種細胞周圍微環境的調節因子，可修飾細胞外環境，導致細胞間質或黏附分子信號轉導的改變，故在腫瘤轉移、器官纖維化和結構重構中起重要作用［8－10］。MT1－MMP在心肌纖維化過程中起重要作用，但MT1－MMP在DM心肌纖維化中的作用目前尚未見報道。硫化氫（H2S）作為一種新發現的氣體信號分子，已有研究［7］顯示：其在心血管系統具有多種生物學效應和心臟保護作用。而H2S是否參與糖尿病心肌纖維化以及信號調控機制，目前尚不清楚。TIMP是MMPs內源性特異性抑制因子，與MMPs激活和活性的調節有關。有研究［11］顯示：H2S參與MMPs／TIMPs的調控，但對DM大鼠心肌組織中MT1－MMP／TIMP－2的調控尚未見報道。本實驗建立DM大鼠模型，觀察氣體信號分子H2S對DM大鼠心肌纖維化以及MT1－MMP蛋白表達和MT1－MMP／TIMP－2失調的影響，探討H2S 在DM心肌纖維化發生發展中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 成年清潔級雄性SD大鼠52只，體質量（280±40）g，購自南華大學動物實驗中心，動物合格證號：SYXK（湘）2010－0006，分籠飼養于清潔級實驗室恒溫（23±1℃）環境中，人工照明，白天黑夜各12h，所有大鼠均可自由獲得水和食物。兔源 MT1－MMP、TIMP－2一抗、兔源Ⅲ型膠原蛋白和GAPDH一抗購于中國博士德公司；硫氫化鈉（NaHS）購于美國Sigma公司；抗兔二抗購于美國Proteintech公司；BCA蛋白定量試劑盒、細胞裂解液購于中國碧云天公司。

1.2 實驗分組及DM模型建立 52只SD大鼠飼養1周后隨機分為對照組、DM組、H2S干預糖尿病組（DM＋H2S組）和H2S干預組（H2S組），每組13只。DM＋H2S組與DM組大鼠按體質量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）40mol·kg－1；注射后24h內給予5%葡萄糖水防止大鼠發生低血糖休克；注射72h后，尾靜脈采血測血糖水平，血糖水平大于16.7mmol·L－1提示造模成功。大鼠在造模后至處死前均有死亡，且集中在造模后2周內，各組死亡數量不等，共死亡大鼠12只，至8周末各組大鼠總生存率為77%（40／52）。造模結束后，對照組、DM組、DM＋H2S組和H2S組剩余實驗大鼠分別為12、9、9和10只。對照組大鼠精神狀反應敏捷，毛色白而光澤。DM大鼠出現不同程度的多食、多尿、多飲和消瘦等癥狀，反應遲鈍，皮毛無光澤。造模成功后，H2S組和DM＋H2S組大鼠每天腹腔注射NaHS溶液（100μmol·kg－1）；而對照組和DM組大鼠每天腹腔注射等量的生理鹽水，持續8周。

1.3 van Gieson（VG）染色觀察大鼠心肌組織病理學形態 將大鼠斷頸處死，取4組大鼠左心室心肌組織，于常規10%甲醛溶液中固定，經逐級脫水、浸蠟、包埋、切片，行VG染色，100倍光鏡下觀察大鼠心肌結構及纖維化程度。

1.4 Western blotting法檢測各組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原蛋白、MT1－MMP和TIMP－2蛋白的表達水平 取4組大鼠新鮮左心室心肌組織，提取蛋白后采用BCA比色法進行定量。蛋白經SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉法將轉至PVDF膜。5%BSA封閉2h后，以Ⅲ型膠原和GAPDH一抗（稀釋度均為1∶400）37℃孵育1h后4℃過夜，用TBST洗膜，以HRP標記的二抗（稀釋度為1∶4000）37℃孵育1h，再次洗膜后以ECL顯色，曝光掃描后以圖像分析軟件進行光密度分析。以目的條帶與GAPDH的灰度比值分別表示Ⅲ型膠原蛋白表達水平。取4組大鼠心肌組織，以MT1－MMP、TIMP－2和GAPDH一抗（稀釋度均為1∶400），37℃孵育1h或4℃過夜，TBST洗膜；以HRP標記的二抗（稀釋度為1∶2000）37℃孵育1h，洗滌和顯影后行灰度掃描，GAPDH作為內參，以目的條帶與GAPDH的灰度比值分別表示 MT1－MMP和TIMP－2的蛋白表達水平。

1.5 統計學分析 采用SPSS 11.0統計軟件進行統計學分析。各組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原、MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達水平以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理形態學 光鏡下觀察VG染色的心肌組織切片，膠原纖維呈紅色。對照組大鼠心肌細胞排列緊密整齊，心肌組織血管周圍及肌間隙中僅有少量膠原沉積；H2S組與對照組大鼠鏡下表現類似。DM組大鼠心肌細胞排列疏散紊亂，心肌組織血管周圍膠原沉積較對照組增多，且向周圍間質延伸，間質可見少量炎細胞浸潤；DM＋H2S組大鼠心肌壁內血管周圍膠原沉積較DM組明顯減少。見圖1（插頁二）。

2.2 各組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原纖維蛋白的表達水平 與對照組（0.9644±0.0176）比較，DM組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原蛋白表達水平（1.1875±0.0407）明顯升高（P＜0.05）； 而DM＋H2S組大鼠心肌組織中的Ⅲ型膠原蛋白的表達水平（0.9999±0.0152）低于 DM組（P＜0.05）。與對照組比較，H2S組大鼠心肌組織中Ⅲ膠原蛋白表達水平（0.9644±0.1777）無明顯變化（P＞0.05）。各組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原蛋白表達電泳圖見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of typeⅢ collagen protein in myocardium tissue of rats in various groups

2.3 各組大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白的表達水平 與對照組比較，STZ組大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與STZ組比較，STZ＋H2S組大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達水平明顯下降（P＜0.05）。H2S組和對照組大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3和表1。

圖3 各組大鼠心肌組織中 MT1－MMP（A）和TIMP－2（B）蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of MT1－MMP（A）and TIMP－2（B）proteins in myocardium tissue of rats in various groups

3 討 論

在諸多DM慢性并發癥中，DC具有極大的危害性，而其發生發展的機制與心肌纖維化有關聯［1－2，12］。心肌纖維化不僅是 DC 心肌重構的主要標志，也是導致左心功能障礙的主要原因。DM心肌纖維化的發病機制尚不十分清楚，但有研究［1－2，13］顯示其發生發展與MMPs／TIMPs的失調有關。MMPs是一大類結構上具有很大同源性的鋅依賴性內肽酶家族，能有效降解細胞間質蛋白質。MT1－MMP是一種表達在細胞膜上的特殊類型的MMP，屬于膜型MMPs，其可作用于多種細胞外基質成分和細胞黏附分子，參與許多重要的生理和病理過程，尤其是組織重構［3］。MT1－MMP的底物有細胞間質的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原和蛋白多糖、層黏蛋白及纖維連結蛋白等，除直接降解細胞間質成分外，MT1－MMP在羧基末端還有一跨膜結構域，可啟動細胞表面多個蛋白級聯反應，因此MT－MMPs的表達增加可觸發瀑布式的MMPs，如MMP－9和MMP－2等激活過程，并進一步促使細胞間質蛋白的降解。有研究［4－5］顯示：在 MMPs由酶原向活性形式轉化的過程中，MT1－MMP起重要的激活作用，故MT1－MMP可通過直接和間接作用參與細胞外基質的降解與改建，在腫瘤遷移和纖維化發生發展過程中起重要作用。本研究結果顯示：正常大鼠心肌組織中，MT1－MMP蛋白有一定表達，但在DM大鼠心肌組織中，MT1－MMP蛋白表達水平則明顯上升，與此同時心肌組織存在明顯間質纖維化，Ⅲ型膠原蛋白的表達水平也明顯升高，提示MT1－MMP表達水平的上調可能參與了DM心肌纖維化的發生。

表1 各組大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of MT1－MMP and TIMP－2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（）

表1 各組大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of MT1－MMP and TIMP－2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs DM group.

Group n MT1－MM2 TIMP－2 Control 121.0178±0.00890.9555±0.0086 DM 91.3489±0.0265＊1.3050±0.0084＊DM＋H2S 91.1671±0.0168△0.8035±0.1324△H2S 101.0414±0.01010.8166±0.0127

當TIMP－2的分子數目遠遠超過 MMPs時，可與活化的MMPs以1∶1比例結合，并抑制其活性，故兩者的平衡對維持正常的膠原代謝具有重要意義，也決定著細胞間基質的降解和重建［13－14］。TIMPs家族中TIMP－2對MMPs的抑制作用最強，當MMPs被激活的同時，TIMP通常也被激活，已有研究［15］顯示：DM 大鼠心肌纖維化過程中TIMP－2表達水平明顯升高。本研究結果顯示：DM大鼠心肌組織中TIMP－2表達水平升高，這可能與MMPs的激活以及細胞間質降解產物的刺激有關。MT1－MMP／TIMPs的表達水平正常應處于動態平衡狀態，從而調控細胞外間質和膠原蛋白的降解和產生。一旦平衡被破壞，MT1－MMP活性增強可引起膠原降解和變性，從而導致心肌間質纖維化。H2S作為新發現的內源性氣體信號分子，參與多種生物學效應及心血管調節作用，尤其是心肌重構［6］。本研究結果顯示：H2S干預后DM大鼠心肌纖維化明顯改善，Ⅲ型膠原表達也明顯下調，提示H2S的干預可改善DM大鼠的心肌間質纖維化；與DM組比較，DM＋H2S組大鼠心肌組織中 MT1－MMP蛋白的表達水平明顯下調，TIMP－2蛋白的表達水平亦下調，提示H2S可能通過下調 MT1－MMP和TIMP－2表達水平以及糾正MT1－MMP／TIMP－2表達失衡，進而減輕 DM 大鼠的心肌纖維化。目前國內外尚無關于H2S下調DM大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達水平的報道，但已有學者［11，16］發現：H2S可下調肝癌細胞和前列腺癌細胞中MMP－9和MMP－2蛋白的表達水平，并抑制腫瘤細胞的遷移。MT1－MMP通過降解細胞間質以及激活其他MMPs參與纖維化進程，并與心肌纖維化發生發展有關［17－20］。H2S改善DM 心肌纖維化的機制可能與下調MT1－MMP表達以及維持MT1－MMP／TIMPs平衡有關，但其中的具體信號機制和應用前景仍有待深入研究。

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