Wnt／β－catenin通路關鍵分子在NK／T細胞淋巴瘤組織中的表達及其臨床意義

秦貝貝，李亞青，李小麗，路禮莎，張旭東，張明智

（1.鄭州大學第一附屬醫院淋巴瘤診療中心，河南 鄭州 450052；2.河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南 鄭州 450052）

NK／T 細胞淋巴瘤（NK／T cell lymphoma，NKTCL）是非霍奇金淋巴瘤的一個亞型，其在亞洲和拉丁美洲發病率明顯高于歐美國家。NKTCL的病理特征為血管中心性浸潤與破壞，常伴明顯的組織壞死，具有高度侵襲性、化療不敏感和預后差的特點［1］。Wnt／β－catenin信號通路調控細胞生長增殖及凋亡等過程，其異常持續性激活參與了腫瘤的發生、侵襲及轉移［2］。已有研究［3－5］證實：該通路在結直腸癌、乳腺癌、套細胞淋巴瘤、彌漫大B細胞淋巴瘤和白血病中有異常激活，但其在NKTCL中的作用鮮有報道。本研究擬分析 Wnt／β－catenin信號通路中關鍵分子β－catenin、c－myc和cyclinD1在NKTCL細胞株SNK－6、YTS 及NKTCL組織中的表達情況，并將其與NKTCL患者臨床特征和預后進行相關性分析，進一步探討Wnt／β－catenin信號通路在NKTCL發病過程中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月—2013年8月鄭州大學第一附屬醫院病理科病理明確診斷為NKTCL的石蠟包埋組織50例，其中男性32例，女性18例，年齡15～75歲，平均年齡46歲，病變均位于鼻腔。取同期的20例淋巴結反應性增生組織作為對照，男性12例，女性8例，年齡17～62歲，平均年齡40歲。NKTCL診斷依照2008年WHO標準：病理改變為瘤細胞血管中心性浸潤并破壞血管，瘤細胞具有NK細胞表型或毒性T細胞表型以及細胞毒表型并與EB病毒感染密切相關。臨床分期按照Ann Arbor分期，其中Ⅰ期5例，Ⅱ期29例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例。所有患者均未做過放療和化療，入院后行放療、化療或綜合治療。每例患者均登記臨床資料，隨訪采用電話、查閱病案資料等方法，隨訪截止至2014年2月，生存期以確診至死亡時間（完全數據）或至隨訪截止時間（截斷數據）計算。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養基購自Solarbio生物醫藥公司；無支原體胎牛血清購自杭州四季青公司；總RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自美國Fermentas生物有限公司；SYBR Green Mixture購自北京康為世紀生物公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；兔抗人β－catenin、c－myc單克隆抗體、免疫組織化學SP染色試劑盒和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋有限公司。

1.3 細胞培養 SNK－6和YTS細胞株為本實驗室長期保存。用含1000U·mL－1白細胞介素2（IL－2）、1%非必需氨基酸和10%胎牛血清的RPMI 1640培養液培養細胞，于37℃、5%CO2培養箱中進行常規懸浮細胞培養，每2～3d傳代1次，選取對數生長期細胞備用。

1.4 細胞系總RNA提取及反轉錄 取對數生長期的細胞，Trizol法提取RNA，經RNA純度檢測A260／A280均在1.80～2.00。參照 Fermentas逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，并于－20℃保存備用。

1.5 Real－time PCR法檢測SNK－6、YTS和正常NK細胞中β－catenin、c－myc及cyclinD1mRNA 的相對表達水平 PCR反應體系：采用25μL體系，模板2.0μL，上、下游引物混均后取2.0μL，SYBR熒光酶12.5μL。反應條件為預變性95℃、10min，變性95℃、15s，變性／延伸 60℃、1min，共40個循環，最后延伸8min。同時以正常NK細胞作為對照，實驗設置3個副孔且重復3次。采用ABI Prism 7500SDS Software軟件進行數據處理，mRNA相對表達水平＝ 2－ΔΔCt，ΔΔCt＝ΔCt細胞株－ΔCt正常NK＝（Ct細胞株－Ctβ－actin）－（Ct正常NK－Ctβ－actin）。引物序列見表1。

表1 基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of genes

1.6 免疫組織化學SP法檢測NKTCL組織和反應性增生的淋巴組織中β－catenin、c－myc蛋白的表達 調節SNK－6和YTS細胞濃度至1×106mL－1，細胞涂片（載玻片經多聚賴氨酸處理），室溫下自然晾干，置于4%多聚甲醛固定液中固定30min，放入0.5%Triton溶液中20min，PBS液沖洗后，室溫下自然涼干后4℃保存。石蠟切片常規脫蠟、水化，3%H2O2去除內源性過氧化物酶及微波爐修復抗原后，PBS沖洗3次，每次3min，10%正常山羊血清室溫下孵育以減少背景非特異性染色，滴加一抗（1∶300稀釋），4℃過夜，PBS漂洗后滴加二抗，室溫孵育30min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.7 免疫組織化學結果判定標準 在顯微鏡下隨機選擇10個高倍鏡視野（×400），每個視野計數100個細胞進行觀察。β－catenin和c－myc均位于細胞核和（或）細胞漿，陽性染色呈棕黃色顆粒。根據腫瘤細胞陽性表達染色強度和陽性細胞數百分比評分。染色強度評分：無色或與背景均勻一致的淡黃色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分（細胞著色深淺需與同一切片背景著色對照）。陽性細胞數百分比評分：陰性為0分，小于10%為1分，10%～50%為2分，大于50%為3分。兩積分乘積：0分為陰性（－），1～3分為弱陽性（＋），4～6分為中等陽性（?），7～9分為強陽性（?）。所有染色結果由本院病理科2名醫生采用雙盲法判定，判斷不一致時再共同進行觀察。

1.8 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。β－catenin、c－myc、cyclinD1mRNA 的相對表達水平以表示，組間比較采用t檢驗；β－catenin和c－myc表達陽性率組間比較采用χ2檢驗；β－catenin和c－myc蛋白表達與患者臨床特征的相關性分析采用Spearman等級相關分析；β－catenin表達與NKTCL患者中位總生存期的關系分析采用Kaplan－Meier法。

2 結 果

2.1 NKTCL細胞株SNK－6和YTS中β－catenin、c－myc和cyclinD1mRNA表達水平 細胞株SNK－6中β－catenin、c－myc和cyclinD1mRNA相對表達水平為 0.036±0.003、0.064±0.004和0.042±0.004，細胞株YTS中β－catenin、c－myc和cyclinD1mRNA 相對表達水平為0.022±0.002、0.040±0.003和0.035±0.004，其相對表達水平均高于正常 NK 細胞（0.010±0.002、0.026±0.003和0.008±0.001）（P＜0.05）。

2.2 NKTCL組織和反應性增生的淋巴結組織中β－catenin、c－myc和cyclinD1的表達 β－catenin和c－myc均定位于細胞漿和（或細胞核）。在 YTS（圖1A和B，見插頁二）和SNK－6（圖1C和D，見插頁二）細胞中，β－catenin和c－myc均呈陽性表達，在正常NK細胞中則呈陰性表達（圖1E和F，見插頁二）。β－catenin在NKTCL組織中陽性表達率為24%（12／50），在20例反應性增生的淋巴結組織中未見陽性表達（圖2A和B，見插頁二）。NKTCL組織中c－myc陽性表達率為56%（28／50），反應性增生的淋巴結組織中c－myc陽性表達率為25%（5／20）（圖2C和D，見插頁二）。NKTCL組織中β－catenin和c－myc的陽性表達率明顯高于反應性增生的淋巴結組織（P＜0.05）。

2.3 不同臨床特征NKTCL患者的β－catenin和c－myc蛋白表達 β－catenin蛋白表達與 Ann Arbor分期有關聯（P＜0.05），c－myc蛋白表達與 Ann Arbor分期、Ki－67水平有關聯（P＜0.05），而二者表達與其他臨床指標均無關聯（P＞0.05）。見表2。

2.4 NKTCL患者中β－catenin和c－myc表達的相關性 28例c－myc陽性表達的患者中β－catenin陽性表達有9例；22例c－myc陰性表達的患者中β－catenin陽性表達有3例。經Spearman秩相關分析，β－catenin和c－myc在NKTCL患者中的表達呈正相關關系（r＝0.770，P＜0.05）。

表2 不同臨床病理特征NKTCL患者β－catenin和c－myc蛋白表達Tab.2 Expressions ofβ－catenin and c－myc proteins of NKTCL patients with different clinicopathological features

2.5 β－catenin表達與NKTCL患者中位總生存期的關系 50例NKTCL患者中，可隨訪者41例，存活25例，死亡16例，生存隨訪期為6～36個月，平均生存期為29.714個月（95%CI：26.606～32.823），β－catenin陽性表達患者平均生存期為（23.662±2.768）個月，β－catenin陰性表達患者平均生存期為（31.656±1.780）個月，經Logrank檢驗，β－catenin表達陽性與陰性患者者平均生存期差異有統計學意義（χ2＝5.193，P＜0.05）。見圖3。

3 討 論

Wnt信號通路與多種腫瘤的發生發展有密切關聯。正常情況下，細胞膜表面和細胞膜下有極少量β－catenin參與細胞間黏附。Wnt信號通路激活時，異常積累的β－catenin進入細胞核，與核內轉錄因子或淋巴細胞增強因子結合，激活下游靶基因c－myc、cyclinD1的轉錄，導致腫瘤細胞異常增殖、浸潤和轉移［6］。此外，β－catenin能誘導正常細胞向瘤性轉化，因此β－catenin被認為是致癌基因［7］。

圖3 β－catenin表達與NKTCL患者總體生存期關系的Kaplan－Meier曲線Fig.3 Kaplan－Meier curves for relationship between expression ofβ－catenin and overall survival rate of NKTCL patients

麥玉潔等［8］在多種白血病／淋巴瘤細胞株中檢測到β－catenin的轉錄和表達水平升高以及細胞核的異常定位，其過量表達提示Wnt信號轉導途徑可能在淋巴瘤細胞中有異常激活。Bellei等［9］研究發現：彌漫大B細胞淋巴瘤患者組織中的β－catenin存在mRNA轉錄水平及蛋白表達水平的升高，并與患者的臨床分期顯著相關。

本研究結果顯示：Wnt信號通路中關鍵組分β－catenin和下游靶基因c－myc、cyclinD1在SNK－6、YTS細胞和NKTCL組織中有不同程度表達，提示該通路可能在NKTCL組織中異常激活。c－myc基因屬于原癌基因，當其表達增加時，可以刺激細胞增生和誘導細胞凋亡［10］。在淋巴反應性增生組織中亦檢測到c－myc的陽性表達，表明其并不是惡性腫瘤的特有標志，只提示細胞增生的活躍程度。cyclinD1基因是細胞周期調節因子，調節細胞從G1期到S期的進程［11］。β－catenin與c－myc的相關分析結果顯示：兩者存在一定的關聯，但并不是相互對應，因此 Wnt／β－catenin只是參與NKTCL發生發展的信號通路之一［12］。免疫組織化學結果顯示：β－catenin的表達與Ann Arbor分期有關聯，c－myc的表達與 Ann Arbor分期、Ki－67水平有關聯，二者與患者年齡、性別、IPI評分、LDH水平、EBER和療效等均無關聯。Kaplan－Meier法分析結果顯示：β－catenin陰性者比陽性者生存時間長，平均生存期分別約為31和23個月。

Wnt／β－catenin信號通路的異常激活，一定程度上促進了NKTCL的發生發展，因此其有望成為監測病情、評估預后的指標。該通路中的重要位點已經嘗試被用于靶向治療。抗真菌藥環吡酮胺和利尿藥依地尼酸可抑制經典Wnt通路在淋巴瘤LY－8和Raji細胞中的激活，并可導致其細胞活性降低及細胞凋亡發生［13］。櫟精是黃酮類物質的典型代表，可以通過降解β－catenin、抑制β－catenin與核內轉錄因子蛋白結合、轉錄因子與特定基因位點的結合，進而發揮抗腫瘤作用，經櫟精處理后多種淋巴瘤細胞株可觀察到明顯的增殖抑制和細胞凋亡現象［14］。

NK／T細胞淋巴瘤是一種具有高度侵襲性的惡性腫瘤，其確切的發病機制尚未清楚［15］。Wnt通路在淋巴細胞發育、分化以及在細胞黏附、極化和運動等方面發揮重要作用，但其與惡性淋巴瘤的發病、侵襲性及治療方案等關系有待進一步研究。本研究結果顯示：Wnt通路中關鍵分子在NKTCL組織中高表達，提示該通路的異常激活可能在NKTCL的發生發展中起一定作用，有利于進一步闡明其發病機制，并獲得基于該通路的靶向治療的可能。

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