用于細胞培養實驗的定量抽氣-充氣方法及相配裝置

潘軒，李璟，熊蕾，唐文峴，張君，汪保和，3

1.湖南師范大學 生命科學學院，湖南 長沙 410081；2.湖南省老年醫院，湖南 長沙 410016；3.湖南省生物發育工程及新產品研發協同創新中心，湖南 長沙 410081

將細胞培養器皿或其放置容器內的空氣抽出，充入組分不同或組分配比不同的氣體，這是建立細胞培養氣體環境的一種方法。然而，細胞培養實驗中沿用的抽氣-充氣方法存在一些不足之處，主要問題是氣體組分定量困難、適用面不寬、耗氣多、耗時長等[1-3]。本文報告一種定量抽氣-充氣法及其相配的抽氣-充氣裝置和配氣-輸氣裝置，能更好地用于細胞培養氣相環境的建立和維持，以及細胞培養基的預先氣體平衡。

1 材料與方法

1.1 抽氣-充氣裝置的構造

如圖1、2 所示，抽氣-充氣裝置由培養容器口組件、抽氣組件、氣體組分充入組件、檢壓計和氣壓平衡袋構成。培養容器是指細胞培養瓶、細胞培養器皿放置盒等容器（本文統稱培養容器），培養容器口組件包括密封塞（或蓋）、抽氣管和充氣管。抽氣組件包括負壓瓶、注射器、二通閥、三通閥1 和連接管。負壓瓶口由硅膠瓶塞密封，瓶塞中貫穿吸氣管和抽水管。吸氣管的瓶內端與瓶塞下表面相平，瓶外端與三通閥1 連接。三通閥1 的另兩個端口分別經管道與培養容器口抽氣管和檢壓計連接。抽水管的瓶內端接近瓶底，瓶外端依次串接二通閥和注射器。氣體組分充入組件包括氣體過濾器（用于阻擋氣體中的微生物和雜質微粒）、三通閥2、貯氣袋、氣體注射器和連接管。氣體過濾器的一端連接于培養容器口充氣管，另一端與三通閥2 連接，三通閥2 的另兩個端口分別連接貯氣袋和氣體注射器。氣壓平衡袋為小容量醫用輸液袋，使用時，將其與三通閥1連接。

圖1 抽氣-充氣裝置結構示意圖

圖2 本實驗室自制抽氣-充氣裝置

1.2 抽氣-充氣裝置的使用

在等溫條件下，將培養容器內1/2 的氣體抽出，接著向容器內充入氣體，其組分或組分配比與抽出氣體不同，而體積與抽出氣體相等。如此進行的一次抽氣和一次充氣計為一輪抽氣-充氣。培養容器內氣體環境的建立需要R（≥1）輪抽氣-充氣，前R-1輪抽氣-充氮或抽氣-充氧，第R輪抽氣-充氣將滿足所需配比的各種氣體組分充入容器。

1.2.1 抽氣-充氣輪數的計算

①培養容器內需O2濃度低于大氣O2濃度的混合氣體，進行R輪抽氣-充氣時，前R-1輪充入N2，第R輪充入各種氣體組分，達到組分配比的要求。用式（1）計算所需的抽氣-充氣輪數R：

式中，Rl-O2為培養容器內氣相空間O2體積分數減至一定數值所需抽氣-充氣輪數；Fi-O2為抽氣-充氣前培養容器內氣相空間的O2體積分數，一般實驗環境條件下，其取值是20.0%；Fc-O2為細胞培養時培養容器內氣相空間所需O2體積分數。

若算得Rl-O2是正整數，直接用其作為實際操作的抽氣-充氣輪數R；若算得Rl-O2是正分數，則用比其大的最小正整數作為實際操作的抽氣-充氣輪數R。

②培養容器內需O2濃度高于大氣O2濃度的混合氣體，進行R輪抽氣-充氣時，前R-1輪充入O2，第R輪充入各種氣體組分，達到組分配比的要求。用式（2）計算所需的抽氣-充氣輪數R：

式中，Rh-O2為培養容器內氣相空間O2體積分數增至一定數值所需抽氣-充氣輪數。

按算得的Rh-O2，實際操作所用抽氣-充氣輪數R的取值方法與Rl-O2相同。

1.2.2R-1 輪抽氣-充氣后培養容器內氣相空間O2體積分數的計算

用式（3）計算R-1輪抽氣-充氮后培養容器內氣相空間O2體積分數Fl-O2：

用式（4）計算R-1輪抽氣-充氧后培養瓶內氣相空間O2體積分數Fh-O2：

1.2.3 第R輪抽氣-充氣中培養容器內需充入氣體組分體積的計算

用式（5）計算第R輪抽氣-充氣中需充入培養容器內的氣體組分體積Vgc：

式中，Vgc包括Vgc-O2、Vgc-CO2、Vgc-N2、Vgc-X，X 表示非O2/非CO2/非N2氣體；Fc為細胞培養時培養容器內氣相空間所需氣體組分體積分數，包括Fc-O2、Fc-CO2、Fc-N2和Fc-X，其中Fc-N2=100%-（Fc-O2+Fc-CO2+Fc-X+Fc-Va），Fc-Va表示細胞培養時培養容器內水蒸汽的體積分數；Fpr為R-1 輪抽氣-充氣后培養容器內氣相空間氣體組分的體積分數，包括Fpr-O2、Fpr-CO2、Fpr-N2和Fpr-X，其中Fpr-O2包括Fl-O2和Fh-O2，Fpr-CO2和Fpr-X均等于0，Fpr-N2=100%-（Fpr-O2+Fpr-CO2+Fpr-X+Fpr-Va）；Vgcp為培養容器內氣相空間的體積；Ti為周圍環境（實驗室內）絕對溫度（K）；Tc為細胞培養時培養容器內絕對溫度（K）。

1.2.4 抽氣-充氣操作方法

抽氣-充氣裝置的部件經滅菌處理備用，抽氣-充氣操作在超凈工作臺的無菌條件下進行，操作步驟如下：①安裝好培養容器口組件；在負壓瓶內裝滿蒸餾水，用瓶塞緊塞瓶口；②連通培養容器與負壓瓶，用注射器將負壓瓶內水抽出，當抽出水體積等于培養容器內氣相空間+抽氣管路內腔之和時，停止抽水，關閉三通閥1；③連通培養容器與N2或O2貯氣袋，貯氣袋內氣體進入培養容器；④連通培養容器和檢壓計，適度擠壓貯氣袋，將袋內氣體繼續充入容器；當容器內氣壓與周圍大氣壓相等時，停止擠壓貯氣袋，關閉三通閥1 和2；⑤如果抽氣-充氣輪數R≥3，重復進行步驟②～④，直至完成R-1輪抽氣-充氣；⑥重復步驟②；⑦用氣體注射器從貯氣袋內抽取體積Vgc的一種氣體組分，將氣體組分注入培養容器；如此重復操作，將所需各種氣體組分注入培養容器；⑧取下抽氣組件和氣體組分充入組件，在三通閥1上連接氣壓平衡袋或配氣-輸氣裝置（下述）。

1.3 配氣-輸氣裝置的構造

為了抵消培養時細胞消耗O2和產生CO2的影響，維持培養容器內氣體組分濃度的穩定，可向容器內輸送既定組分配比的混合氣體，配氣-輸氣裝置用于混合氣體的配制和輸送。

如圖3、4 所示，配氣-輸氣裝置由通水動力瓶、配氣袋、檢壓計、蠕動泵、氣體過濾器、濕化瓶、氣閥和連接管路組成。通水動力瓶的主體是下嘴玻璃瓶，其容量為2～5 L，瓶口由硅膠塞密封，瓶塞中貫穿排氣管和通氣管。排氣管的瓶內端與瓶塞的下表面相平，其瓶外端連接硅膠管。通氣管的瓶內端伸入玻璃瓶內約2 cm，連接配氣袋；瓶外端連接三通閥1。三通閥1 的另兩個端口分別連接貯氣袋和三通閥2。在三通閥2的另兩個端口上，一個連接檢壓計，一個依次串接三通閥3、氣體過濾器和濕化瓶。濕化瓶口由瓶塞密封，瓶塞中貫穿進氣管和輸氣管，進氣管的瓶內端接近瓶底，瓶外端連接氣體過濾器；輸氣管的瓶內端與瓶塞下表面相平，瓶外端經硅膠管與培養容器口組件的充氣管連接。通水動力瓶的下嘴也由硅膠塞密封，一根通水管貫穿下嘴塞。通水管的瓶外端連接三通閥4，三通閥4的另兩個端口分別連接蠕動泵和放水管。

1.4 配氣-輸氣裝置的使用

①用式（6）計算配氣袋內配制混合氣體所需各種氣體組分的體積：

圖3 配氣-輸氣裝置結構示意圖

圖4 本實驗室自制配氣-輸氣裝置

式中，Vgc'為配氣袋內需充入的氣體組分體積；Fc和Fc-Va同式（5）；Vm為配氣袋內需配混合氣體的體積；②在通水動力瓶內加約一滿瓶水，用注射器將配氣袋內氣體抽凈，將配氣袋置入瓶內，并用硅膠塞緊塞瓶口；③通過通水管向玻璃瓶內注水，使瓶內水面上方的氣體經排氣管排出，然后將排氣管夾閉；④取裝有第1 種氣體組分的貯氣袋，將其與三通閥1 連接，使配氣袋與貯氣袋連通，也與檢壓計連通；⑤由放水管放出通水動力瓶內的水，貯氣袋內氣體進入配氣袋，當放出水的體積達到第1 種氣體組分所需體積Vgc'時，停止放水；在配氣袋內氣壓與周圍大氣壓平衡的狀態下，關閉三通閥1；⑥用裝有第2 種氣體組分的貯氣袋替換第1 種氣體組分貯氣袋，按步驟④和⑤同法操作，將第2 種氣體組分充入配氣袋內；如此類推，將第3 種或更多種氣體組分充入配氣袋；然后，取下配氣-輸氣裝置上的貯氣袋和檢壓計；⑦在濕化瓶中加接近一滿瓶37℃無菌蒸餾水，塞緊瓶塞，連通配氣袋與濕化瓶；⑧開動蠕動泵，以一定流速向通水動力瓶內注水，配氣袋內的混合氣體經濕化瓶輸氣管排至外界；當管路中充滿配氣袋內輸出的混合氣體時，將與輸氣管與培養容器口充氣管連接，并打開培養容器口抽氣管上的三通閥；調低蠕動泵向玻璃瓶內注水的流速（一般可為10～100 L/min），使配氣袋內混合氣體輸入培養容器。

1.5 氣體組分體積分數的檢測

開啟空調，保持室溫為20℃；在25 mL培養瓶內加入DMEM 培養液2.5 mL，使用上述抽氣-充氣裝置，以Ti=293K、Tc=310K、N2為平衡氣，在培養瓶內分別混配O2和CO2不同配比（見結果部分）的4 種混合氣體；通過培養容器口組件向培養瓶內注入DMEM培養液10 mL，同時從培養瓶內抽出10 mL 混合氣體；將抽出的混合氣體注入放有干燥劑片并已抽真空的塑料袋中，5 min 后從袋內抽出干燥的混合氣，注入CO2和氧氣記錄分析儀（TFS-CO2/O2 型，株洲市拓達電子有限公司），檢測O2體積分數和CO2體積分數；將檢測值乘以0.94（Fc-Va=6%），算出培養瓶氣相空間的O2和CO2體積分數。

使用配氣-輸氣裝置，在其配氣袋內，以Fc-Va=6%、N2為平衡氣，分別混配O2和CO2不同配比（見結果部分）的4 種混合氣體；向配氣袋所在下嘴玻璃瓶內注水10 mL，從配氣袋內抽出10 mL混合氣體，用上述CO2和氧氣記錄分析儀檢測O2體積分數和CO2體積分數。

1.6 培養基氣體平衡

配制含20%胎牛血清的DMEM 液，加入30 mL容量的玻璃瓶中，每瓶10 mL，塞緊硅膠瓶塞；用抽氣-充氣裝置，分別在這些玻璃瓶內配制3 種混合氣體，O2濃度分別為1%、20%、40%，各種混合氣體的CO2濃度均為10%，均用N2作為平衡氣體；將配好混合氣體的玻璃瓶置于水平回旋搖床，以10/min 的頻率回旋30 min，貯存備用。

1.7 MC-3T3-E1細胞的培養

用胰酶法將貼壁生長至亞融合的MC-3T3-E1細胞消化下來，離心洗滌后重懸，計數，制成含10%胎牛血清的DMEM 單細胞懸液，細胞濃度1×104/mL。將單細胞懸液種入12.5 cm2培養瓶，2.5 mL/瓶。細胞分為1%、20%、80% O2濃度組，各組CO2濃度均為10%，N2作為平衡氣體。各組培養瓶內的混合氣體均用前述抽氣-充氣法配制。將各組細胞置于37℃恒溫培養箱，培養48 h 后行Wright-Giemsa染色，按參考文獻[4]做原位細胞計數，拍照。

1.8 CFU-F集落形成實驗

用頸椎脫臼法處死KM 小鼠，無菌條件下取股骨和脛骨骨髓，制成骨髓單細胞懸液，計數。骨髓細胞混懸于含20%胎牛血清的DMEM 液中，細胞濃度1×106/mL，種入35 mm 培養皿，2 mL/皿。細胞分為1%、20%、40% O2濃度組，各組CO2濃度均為10%，N2作為平衡氣體。各組培養皿分別放入自制的細胞培養環境盒，用前述抽氣-充氣法在各組環境盒內配制混合氣體。將環境盒置于37℃恒溫培養箱，培養2 d 后，吸出培養皿內培養液和未貼壁細胞，換入前述已做氣體平衡培養液。將培養皿再放入細胞培養環境盒，仍按上述組分配比分別在3 個實驗組的環境盒內配制混合氣體，并使用前述配氣-輸氣裝置配制與環境盒內組分配比相同的混合氣體，以20 L/min的流速將混合氣體分別輸入環境盒，在37℃下培養，每天輸氣12 h。繼續培養7 d 后，行Wright-Giemsa染色，顯微鏡下計數CFU-F集落（≥20個成纖維細胞的聚合計為1個集落），拍照。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 培養瓶內混配氣體的組分體積分數

培養瓶內4 種混合氣體的O2和CO2體積配比預定值見表1。在各種配比的混合氣體中，O2體積分數檢測值與預定值的差值在1%以內。配比1 混合氣體的O2體積分數檢測值與預定值的差值僅0.17%，但由于預定值小，誤差達17%；配比2、3、4 混合氣體的O2體積分數檢測值相對于預定值的誤差≤6%。各種配比混合氣體的CO2體積分數檢測值與預定值的差值在1.2%以內，誤差＜12.0%。

2.2 配氣袋內混配氣體的組分體積分數

配氣袋內4 種混合氣體的O2和CO2體積配比預定值見表2。配比1 混合氣體的O2體積分數檢測值與預定值的差值為0.13%，誤差為11%；配比2、3、4混合氣體的O2體積分數檢測值與預定值的差值在0.8%以內，誤差＜3%。各種配比混合氣體中，CO2體積分數檢測值與預定值的差值在0.5%以內，誤差＜6%。

2.3 不同O2濃度條件下MC-3T3-E1細胞的生長

在1%、20%和80% O2濃度培養條件下，MC-3T3-E1 細胞的生長表現出明顯差異，培養瓶細胞計數結果依次為（96.5±29.6）×103、（250.4±81.0）×103和（8.8±3.9）×103。與20% O2組比，1% O2組和80% O2組的細胞數均減少，差異均有顯著性意義（圖5）。

2.4 不同O2濃度培養條件下CFU-F集落的形成

在1%、20%和40% O2濃度的培養條件下，小鼠骨髓CFU-F 集落的生成表現出明顯差異（圖7），每106骨髓有核細胞的CFU-F 集落數依次為8.0±3.3、17.7±4.7 和2.3±0.8。與20% O2組比，1% O2組和40% O2組的CFU-F集落形成率均減低，差異均有顯著性意義（圖6）。

表1 培養瓶內氣體組分體積分數的預定值和檢測值（n=3）

表2 配氣袋內氣體組分體積分數的預定值和檢測值（n=3）

3 討論

上述混配氣體組分體積分數檢測結果表明，在培養瓶內和培養器皿放置容器內，用定量抽氣-充氣法（該方法已獲專利授權，專利號201420836800.2）能直接配制細胞培養環境所需組分配比的混合氣體；細胞培養結果進一步證明了這種抽氣-充氣法用于細胞培養實驗的可靠性和有效性。這種方法也能用于細胞培養基的預先氣體平衡。

不論在細胞培養器皿或其放置容器內建立細胞培養氣相環境，還是在細胞培養基貯器內進行預先氣體平衡，都須將容器內空氣置換成一定組分配比的混合氣體。常用方法是將已配好的混合氣體持續通入容器，同時使容器內的空氣排出，通過逐漸稀釋作用，建立細胞培養氣相環境[5-7]。這一方法費時費氣，并且需要預配混合氣體。為克服其弊端可采用另一種方法，即先將容器中的原有氣體部分抽出，然后把組分氣體和被試氣體定量充入容器[3,8-9]。這種方法要求抽氣和充氣定量進行，但是其定量問題并未得到有效可行的解決[10-11]。本文報道了用于定量抽氣-充氣的一系列公式，這些公式的推導除了以抽氣-充氣容器內氣相空間體積、容器內原有氣體的組分濃度和細胞培養環境所需氣體組分濃度為基本參數，還充分考慮了水蒸汽和溫度等因素。在常規細胞培養溫度（37℃）下，水蒸汽在氣相環境中所占體積比約達6%；一般室溫與細胞培養溫度具有一定的差值，對培養器皿或其放置容器內抽氣和充氣的定量產生影響[12]，而在以往細胞培養氣相環境的建立中，忽略了這些因素的影響[13]。將這些公式用于抽氣-充氣的定量計算，能更好地滿足細胞培養氣相環境中各種組分和被試氣體的定量要求。

圖5 不同O2濃度培養條件下MC-3T3-E1細胞的生長

圖6 不同O2濃度培養條件下CFU-F集落的形成

在操作上，本文的抽氣-充氣法比細胞培養實驗沿用的抽氣-充氣法更為簡便實用。使用注射器進行手工操作，就能將容器內1/2 的氣體抽出，而不必用電動真空泵抽氣。借助與被抽氣容器相連通的負壓瓶，通過從瓶內抽水造成負壓而抽出容器內氣體，使得抽氣定量更加自如，抽氣量不受注射器容量的限制。抽氣之后的容器內充氣可由貯氣袋直接輸入，或用注射器從袋內抽取氣體后注入容器。通過氣體組分定量加入容器，能在容器內建立各種氣體組分配比的氣相環境，不須預先配好混合氣體，還省時省氣。而且，使用貯氣袋裝納組分氣體和被試氣體，可用氣體種類多、來源廣，除了市售氣體，還可采集各種環境氣體和實驗室自制氣體，不受氣體量少的限制。因此，本文的抽氣-充氣法除了能方便地用于各級O2、CO2和N2濃度條件下的細胞培養實驗，也能方便地用于研究各種環境污染氣體、麻醉氣體和其他氣體生物效應和有害作用的細胞培養實驗。

直接在培養容器內建立所需氣相環境后，如果在容器密閉條件下進行長時間細胞培養，細胞代謝的O2消耗和CO2產生將使氣相環境的氣體組分濃度有所改變。為了嚴格維持細胞培養環境中的O2和CO2濃度的穩定，可向容器內輸送既定組分配比的混合氣體。本文所述配氣-輸氣裝置運用水-氣等量置換技術，能按組分配比要求配制各種組分濃度的混合氣體，并能將所配混合氣體控速輸入細胞培養器皿或其放置容器（已申請該裝置的專利，申請號201310365440.2）。如果細胞培養所需時間較短，相對于容器內O2和CO2總量來說，細胞的O2消耗量和CO2產生量極少，培養環境中O2和CO2濃度的變化可被忽略[14]。這種情況下，可不必向容器內輸送氣體。但是，將容器密閉從室溫條件下放入恒溫培養箱后，升溫性氣體膨脹將使容器內氣壓高于周圍大氣壓[15]。使用本文所述氣壓平衡袋，能簡單而可靠地保持培養容器內氣壓與周圍大氣壓之間的平衡。

總之，本文所述抽氣-充氣法及相配裝置的可靠性高、適用性強、費用低廉，可作為細胞培養氣相環境建立和維持方法和裝置的有益選擇。

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