光果甘草原生質體分離條件優化

王禮強，楊瑞，袁伯川，劉春生，劉穎

北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100102

甘草是我國最常用的大宗藥材之一，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛和調和諸藥等作用[1]。根據《中華人民共和國藥典》的規定[2]，藥材甘草有3 個基原，即烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）、光果甘草（G.glabraL.）和脹果甘草（G.inflataBat.）。目前，有關甘草的研究多集中于烏拉爾甘草，涉及功能基因克隆、異源表達、化學成分分析等諸多方面[3-6]，對光果甘草的研究則相對較少。雖然烏拉爾甘草與光果甘草同為藥材甘草的基原植物，其化學成分及相應的藥理活性卻具有較大的差異[7-8]，因此對于光果甘草的研究也須提上日程。

目前野生甘草資源日趨匱乏，且存在藥效成分不穩定及種子市場混亂等現象，因此栽培甘草已經成為主流商品。但栽培甘草普遍存在品質退化及甘草酸含量低等問題，難以達到我國藥典和日本藥典規定的合格標準。因此，通過現代生物技術對甘草進行遺傳改良，提高栽培甘草的質量，對于甘草資源的可持續發展具有十分重要的意義。原生質體是遺傳轉化研究中十分理想的材料，一方面可以有目的地向原生質體中轉入特定基因，改良植物的性狀；另一方面，在原生質體再生植株的過程中較易發生無性系變異，對其進行人工理化誘導，則可選育出有利用價值的突變體植株[9]；此外，通過原生質體融合還可以克服遠緣雜交的不親和障礙，獲得有價值的雜種后代[10]。因此，甘草原生質體的分離可以為進一步的遺傳轉化及體細胞雜交奠定基礎。目前，有關甘草原生質體分離的報道僅見烏拉爾甘草分離條件的相關研究[11]，光果甘草尚未見同類報道。

我們以光果甘草為研究對象，從多個方面對其原生質體的分離進行探討，并確定了最優分離條件，以期為光果甘草原生質體培養以及在此基礎上的遺傳轉化研究提供大量優質的原生質體材料來源。

1 材料和方法

1.1 材料

生長7 d 的光果甘草無菌苗的葉片及胚軸部分由本實驗制備。纖維素酶（Onozuka R-10）、果膠酶（Yakult Y-23）、離析酶（Yakult R-10）及KH2PO4、KNO3、MgSO4·7H2O、KI、無水CaCl2、CuSO4·5H2O、甘露醇等化學試劑（分析純）購于北京拜爾迪生物技術有限公司；Olympus 普通復式光學顯微鏡；哈東聯超凈工作臺；Anke TGL-16G 離心機；Eppendorf微量移液器。

1.2 不同酶液組合及供試材料對光果甘草原生質體分離的影響

用于原生質體分離的酶液組合見表1，各處理均用CPW-13%甘露醇溶液配制，經0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。

無菌條件下取生長7 d 的光果甘草無菌苗的子葉和胚軸，準確稱取子葉及胚軸100 mg 至無菌1.5 mL 離心管中（各27 份，每種酶液組合3 個重復），按照10∶1 的比例加入表1 中各酶液，用Parafilm 封口；25℃黑暗恒溫培養箱中靜置酶解12 h，60 目細胞篩網過濾，用5 mL CPW-13%甘露醇溶液洗滌；將濾液收集于15 mL 離心管中，1200 r/min 離心10 min；棄上清，將沉淀用8 mL CPW-25%蔗糖溶液懸浮后，沿管壁緩慢在蔗糖層上加入2 mL CPW-13%甘露醇溶液，800 r/min 離心10 min；小心吸取界面上的原生質體懸浮液，置于另一離心管中，加入5 mL CPW-13%甘露醇溶液，1200 r/min 離心10 min；收集沉淀，溶于1 mL MS 液體培養基中；臺盼藍染色；用血球計數板分別計數死、活細胞；計算原生質體活力及產量。

表1 光果甘草原生質體分離所用各酶液組合

1.3 不同酶解時間及酶解方式對光果甘草原生質體分離的影響

25℃條件下，采用表1中的5號酶液，對生長7 d的光果甘草無菌苗的子葉進行酶解，設置6、8、10、12、14、16 h 共6 種酶解時間，靜置酶解及40 r/min振動2種酶解方式，各處理分別進行3個重復。其他實驗步驟同1.2。

1.4 不同低溫預處理方法對光果甘草原生質體分離的影響

25℃條件下，采用表1中的5號酶液，對生長7 d的光果甘草無菌苗的子葉進行酶解，設置5 種低溫預處理條件，即4℃預培養4、8、12、18、24 h，以未進行低溫預處理的甘草外植體作為對照組，每處理各進行3個重復，靜置條件下酶解14 h，其他實驗步驟同1.2。

1.5 不同滲透壓對光果甘草原生質體分離的影響

以生長7 d 的光果甘草無菌苗的子葉作為實驗材料，設置6 種滲透壓條件，即甘露醇0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8 mol/L，分別用含有以上濃度甘露醇的CPW 溶液配制表1 中的5 號酶液，并作為實驗用酶液，每種酶液各進行3 個重復，靜置條件下酶解14 h，其他實驗步驟同1.2。

1.6 光果甘草原生質體產量和活力的計算方法

采用臺盼藍染色方法鑒別原生質體的死活，死亡的原生質體著色，而生活的原生質體不著色。

原生質體活力=活的原生質體數/原生質體總數

原生質體密度（1 mL原生質體懸液中的原生質體個數）=4個大格中的原生質體數×104/4

因為本實驗中每種不同的處理均稱取了100 mg 實驗材料，所以當以每鮮克重（gfw）的原生質體數目為單位表示原生質體產量時，計算方法如下：

原生質體產量（個/gfw）=原生質體密度×10

2 結果與討論

2.1 不同酶液組合及供試材料對光果甘草原生質體分離的影響

如表2 所示，就原生質體產量而言，以子葉作為實驗材料要顯著高于以胚軸作為實驗材料，其倍數從幾倍至十幾倍不等，因此子葉是分離光果甘草原生質體的最佳實驗材料。就分離效果而言，3、5 及8號酶液的分離效果均較好，但3 號酶液原生質體活力僅為56.32%，8 號酶液原生質體產量僅為11.98×105個/gfw。綜合考慮原生質體產量和活力兩個方面的因素，確定了5 號酶液，即1.5%纖維素酶+0.5%果膠酶的組合為最佳酶液組合。

2.2 不同酶解時間及酶解方式對光果甘草原生質體分離的影響

如表3 所示，在靜置條件下，原生質體產量隨著酶解時間的延長呈先上升后下降的趨勢，以6 h 酶解所獲得的原生質體最少，為2.06×105個/gfw，14 h酶解所獲得的原生質體達到頂峰，為30.77×105個/gfw，而酶解時間繼續延長到16 h，原生質體產量則略有下降，為23.98×105個/gfw。就原生質體活力而言，除6 h樣本外，也呈現出先升后降的趨勢，以8 h酶解活力最低，為54.0%，14 h 時活力最高，為66.9%，繼續延長酶解時間至16 h，原生質體活力會顯著下降至只有38.9%，這也證明了太長的酶解時間可能會導致原生質體的破壞，從而降低其活力。

采用40 r/min 緩慢振蕩的酶解方式，原生質體產量隨著酶解時間的延長逐漸上升，當酶解時間為12 h時達到最高值，即45.10×105個/gfw，但當酶解時間繼續延長時，原生質體產量不再升高，反而開始下降。就原生質體活力而言，除酶解6 h 之外，在其他酶解時間，原生質體活力均較為接近，但均較靜置酶解方式原生質體活力低，僅為靜置酶解原生質體活力的約2/3。

因此，綜合考慮原生質體活力及產量兩個方面的因素，認為靜置酶解14 h的方式較為適宜。

2.3 不同低溫預處理方法對光果甘草原生質體分離的影響

如表4 所示，隨著4℃預培養時間的延長，光果甘草原生質體活力及產量均呈現先升后降的趨勢，到12 h 時達到最高值，但繼續延長低溫預培養的時間，原生質體的活力和產量不再上升，反而開始下降，24 h 時活力已不足50%。而未進行低溫預培養時，原生質體活力較低溫預培養8、12 h 時的活力低，但在產量方面，未低溫預培養實驗組的原生質體產量較高，僅低于4℃預培養12 h 實驗組。綜上，4℃預培養12 h 有利于提高光果甘草原生質體的活力和產量。

表2 酶液成分及供試材料對光果甘草原生質體分離效果的影響

表3 不同酶解時間及酶解方式對光果甘草原生質體分離的影響

2.4 不同滲透壓對光果甘草原生質體分離的影響

如表5 所示，隨著甘露醇濃度的升高，光果甘草原生質體的活力呈現先上升后下降的趨勢，當甘露醇濃度為0.7 mol/L 時達到最大值，即63.7%，此后，甘露醇濃度繼續升高，光果甘草原生質體的活力開始下降。就原生質體產量而言，隨著甘露醇濃度的升高，也基本呈現先升后降的趨勢，產量最高值也出現在甘露醇濃度為0.7 mol/L 時，為28.37×105個/gfw。綜上，在對光果甘草進行原生質體分離時，最佳甘露醇使用濃度為0.7 mol/L，太低及太高的甘露醇濃度均難以達到良好的滲透穩定作用。

2.5 小結

我們從材料來源、酶液組成、酶解方式、酶解時間、滲透壓、預處理方式等6 個方面對光果甘草原生質體的分離進行了研究，并確定了最優化的分離條件，即：以生長7 d 的光果甘草無菌苗的葉片作為分離原生質體的外植體材料，在4℃條件下于MS 基本培養基上預培養12 h，以1.5%纖維素酶+0.5%果膠酶作為分離原生質體所用酶液，以含0.7 mol/L 甘露醇作為滲透保護劑的CPW 溶液配制酶液，25℃條件下靜置酶解14 h。以此條件獲得的光果甘草原生質體完整、透明，質量良好。本實驗結果將為光果甘草原生質體融合及遺傳轉化奠定良好的基礎。

表4 低溫預處理對甘草原生質體分離的影響

表5 不同滲透壓對甘草原生質體分離的影響

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