結核分枝桿菌抗體雙抗原夾心ELISA 檢測方法的建立及初步應用

蔣紓芳 ，郭蘭芹，宗克亮，楊錫琴，劉志強，趙照，修冰水，段翠密，陳堃，張旭輝，張嶸，馮曉燕，張賀秋

1.軍事醫學科學院 基礎醫學研究所，北京 100850；2.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016；3.華北石油總醫院，河北 任丘 062552；4.風帆集團 職工醫院，河北 保定 071000；5.首都師范大學 數學科學學院，北京 100148

結核病（tuberculosis，TB）是一種由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的嚴重危害人類健康的呼吸道傳染病，是全球性的重大公共衛生問題和社會問題[1]。據世界衛生組織統計，全世界每年約300 萬人死于TB，是造成死亡人數最多的單一傳染病。我國是全世界22 個TB 高負擔國家之一，患者人數僅次于印度而位居全球第二，這說明我國TB流行趨勢嚴峻，不可小覷[2]。流動人口增加、免疫力下降、耐藥性菌株的出現，以及艾滋病共感染等因素，加速了結核病的感染復發與進一步流行。

酶聯免疫測定技術（ELISA）是以免疫學反應為基礎，將抗原-抗體的特異性反應與酶和底物的高效催化作用相結合的一種敏感性很高的技術。臨床上常用間接ELISA法檢測TB患者血清中的IgG抗體水平，但IgG 抗體出現較晚，對TB 的早期感染會產生漏檢，血清中非特異性物質的吸附干擾也會導致假陽性結果出現。研究表明[3]，同時使用間接ELISA 法檢測TB 患者血清中的IgG、IgM 和IgA 抗體可顯著提高陽性檢出率，但聯合檢測費用較單一檢測高，增加了患者的經濟負擔。為了改進Mtb 血清學診斷方法，我們建立了2種檢測抗Mtb總抗體的雙抗原夾心ELISA 法，即辣根過氧化物酶（HRP）標記組雙抗原夾心ELISA 和生物素標記組雙抗原夾心ELISA（以下簡稱HRP-ELISA 法和Bio-ELISA 法），并利用臨床患者樣本初步評價了2種方法的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

所有血清均來自北京市朝陽區疾病預防控制中心，全部為臨床新近診斷的活動性肺結核患者，未合并感染人免疫缺陷病毒（HIV），未接受抗結核治療；陰性對照組來自健康體檢者。

融合抗原38kD+ESAT6+CFP10（以下簡稱38+6+10）為本室構建并保存；HRP 購自Sigma 公司；生物素購自Thermo公司；SA-HRP購自VECTOR公司；NaIO4、NaBH4、DMSO、丙三醇、硫酸均為國產分析純產品；SM-3 型自動化酶免分析儀、ZMX-988B 型自動化酶免洗板機均為北京天石天力醫療器械有限公司產品；CU420 型電熱恒溫水箱為上海一恒科技有限公司產品；96 孔酶聯板為廈門怡佳美實驗器材有限公司產品。

1.2 HRP標記融合抗原38+6+10

將1 mL 5 mg/mL 融合抗原裝入透析袋，用0.01 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH9.5）1000 mL 于4℃透析48 h；取5 mg HRP 溶于0.5 mL 去離子水；加0.5 mL 0.06 mol/L NaIO4，室溫下避光輕攪20 min，液體呈黃綠色；加0.5 mL 0.16 mol/L 乙二醇，室溫下避光輕攪30 min，終止氧化反應；裝入透析袋，用0.01 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH9.5）1000 mL 于4℃透析過夜；將透析后的酶標抗原倒入棕色小瓶，加入0.2 mL 5 mg/mL NaBH4，4℃穩定2 h 后，加等量的甘油，小量分裝，低溫保存備用。

1.3 生物素標記融合抗原38+6+10

將1 mL 2 mg/mL 的融合抗原裝入透析袋，用0.01 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH9.5）1000 mL 于4℃透析48 h；加10 μL 用20 μg/μL DMSO 溶解的生物素，室溫穩定1～2 h；裝入透析袋，用0.02 mol/L PBS緩沖液（pH7.4）1000 mL 于4℃透析過夜；小量分裝，低溫保存備用。

1.4 雙抗原夾心ELISA法的優化

采用5份健康對照和6份不同反應強度的TB 患者血清樣本，對融合抗原包被濃度以及標記抗原稀釋率進行優化，分別計算TB患者血清平均吸光度值P，健康對照血清平均吸光度值N，選擇最大P/N 值所對應的反應條件作為最佳反應條件。ELISA 法的具體優化步驟如下：

①將融合抗原38+6+10 用包被液稀釋至2、1、0.5 和0.25 μg/mL，100 μL/孔包被96 孔酶聯板，4℃過夜；②洗板2 次后拍干，110 μL/孔加入封閉液，室溫封閉8 h 后棄液拍干；③100 μL/孔加入血清樣本原液，37℃孵育30 min；④洗板5 次后拍干，100 μL/孔加入1∶500 稀釋的HRP-38+6+10，37℃孵育20 min（Bio-ELISA 法的此步為：100 μL/孔加入1∶2000稀釋的Bio-38+6+10，37℃孵育30 min，洗板5 次后拍干，100 μL/孔加入1∶1000 稀釋的SA-HRP，37℃孵育20 min）；⑤洗板5 次后拍干，加入TMB 顯色液A 和B 各50 μL/孔，37℃避光顯色10 min；⑥50 μL/孔加入1 mol/L 硫酸，用酶標儀讀取D450nm和D620nm值，分別比較4 組不同抗原包被濃度的P/N 值，選擇P/N較大者作為最佳抗原包被濃度；⑦用已確定的最佳抗原包被濃度包被酶聯板，將待檢血清與樣品稀釋液的加樣量分別按比例10+90、20+80、30+70、40+60和100 μL血清原液加入酶聯板各孔中，其他反應條件相同，按上述步驟進行檢測，分別比較5 組不同樣品稀釋率的P/N值，選擇P/N值較大者作為最佳樣品稀釋率；⑧用已確定的最佳抗原包被濃度包被酶聯板，并用所確定的樣品稀釋率加樣后，將HRP-38+6+10 按1∶500、1∶1000 稀釋，將Bio-38+6+10 按1∶2000、1∶4000 稀釋，其他反應條件相同，按上述步驟進行檢測，分別比較2組不同標記抗原稀釋率的P/N值，選擇P/N值較大者作為最佳標記抗原稀釋率。

1.5 已建立雙抗原夾心ELISA法的初步應用

用最佳反應條件建立的HRP-ELISA 法和Bio-ELISA法檢測血清樣本，根據檢測結果計算2種檢測方法的靈敏度、特異性、P/N值和AUC。

1.6 統計學方法

應用SPSS 17.0 和GraphPad Prism 6 統計分析軟件對數據進行統計學分析。分析結果中P 為TB患者的平均吸光度值，N 為健康人的平均吸光度值；AUC 表示受試者工作特征曲線下的面積，該值越大且越接近于1即表明該方法的診斷效能越好。

2 結果

2.1 最佳反應條件的確定

2.1.1 融合抗原包被濃度的確定 將融合抗原按不同包被濃度進行包被，其他條件相同下進行ELISA檢測，結果見表1、2。HRP-ELISA 法和Bio-ELISA法的融合抗原分別按2、0.25 μg/mL 包被時得到的P/N值最高，為各自的最佳包被濃度。

2.1.2 樣品稀釋率的確定 用已確定的最佳抗原包被濃度包被酶聯板后，將待檢血清與樣品稀釋液的加樣量分別按不同比例加入酶聯板各孔中，其他條件相同下進行ELISA 檢測，結果見表3、4。HRPELISA法和Bio-ELISA法均在加入100 μL血清原液時得到的P/N值最高，為各自的最佳樣品稀釋率。

2.1.3 標記抗原稀釋率的確定 用已確定的包被濃度進行包被，并用所確定的樣品稀釋率加樣后，將標記抗原按不同稀釋率進行稀釋，其他條件相同下進行ELISA檢測，結果見表5、6。HRP-ELISA 法 和Bio-ELISA 法分別按1∶500、1∶2000 稀釋時得到的P/N值最高，為各自的最佳標記抗原稀釋率。

2.2 對血清樣本的檢測結果

用所確定的最佳反應條件對71 份TB 患者和90份健康對照血清的檢測結果見表7，HRP-ELISA 法和Bio-ELISA 法的散點圖和ROC 曲線見圖1。Bio-ELISA 法的臨界值為0.044，顯著低于HRP-ELISA法，靈敏度 為52.11%、P/N 值 為74.42、AUC 為0.9746，均顯著高于HRP-ELISA 法。HRP-ELISA 法和Bio-ELISA 法的TB 患者抗體水平均顯著高于健康對照，差異具有統計學意義（均為P＜0.0001）。

表1 HRP-ELISA法融合抗原包被濃度的選擇

表2 Bio-ELISA法融合抗原包被濃度的選擇

表3 HRP-ELISA法樣品稀釋率的選擇

表4 Bio-ELISA法樣品稀釋率的選擇

3 討論

生物素-親合素系統（biotin-avidin system，BAS）是20 世紀70 年代后期應用于免疫學，并得到迅速發展的一種新型生物反應放大系統。它具有多級放大效應，并與熒光素、酶、放射性核素等免疫標記技術有機地結合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高，已經廣泛應用于生物醫學研究的各個領域。生物素廣泛分布于動、植物組織中，在機體內以輔酶形式參與各種羧化酶反應，故又稱為輔酶R或維生素H。它有2個環狀結構，分別為咪唑酮環（與親合素結合的主要部位）和噻吩環（其末端羧基是結合抗體和其他生物大分子的惟一結構）。鏈霉親合素（streptavidin，SA）和生物素之間的親和力極強，一個SA 分子可以結合4 個生物素分子，二者的親和常數為1015/mol，比抗原與抗體的親和力至少高1 萬倍[4]。因此二者能快速結合且反應不易受外界干擾，具有高度特異性和穩定性，所以在實際應用中BAS的精確度較高、操作誤差較小。

本研究中所用的抗原是由本實驗室已構建、表達和純化的高活性融合抗原38+6+10，包含38kD 抗原、ESAT6和CFP10的優勢表位抗原區段，在先前建立的間接ELISA 法結核IgG 抗體檢測技術中已證明該融合抗原具有較好的靈敏度和特異性[5]。其中38kD 是一種磷酸鹽轉運蛋白，參與磷鹽的代謝，是Mtb 的主要抗原，因此用于TB 血清學診斷檢測的靈敏度和特異性均較高。它只在分枝桿菌復合體中表達，且卡介苗（BCG）合成38kD 蛋白的量只有Mtb 的1/10，是目前最為常用的TB 診斷抗原之一。同時，它是最早發展用于商業化診斷試劑盒的抗原，對活動性肺結核的診斷效果較好[6]。ESAT6 是一種主要的Mtb 分泌蛋白，具有良好的抗原性。1996 年Harboe 等通過PCR、Southern 雜交和免疫印跡分析，從基因和蛋白水平上揭示ESAT6僅存在于致病性分枝桿菌（如Mtb、牛分枝桿菌）中，而不存在于BCG 及其他非致病分枝桿菌中[7]。CFP10 基因位于ESAT6 基因的上游，以單拷貝的形式分布于相同的分枝桿菌中，在BCG 所有菌株中不存在。它與ESAT6 約有40%的同源性，且具有相同的免疫學特性[8]，能夠刺激機體產生特異性細胞免疫應答。同時，CFP10 蛋白具有與天然蛋白相同的抗原性，可誘發結核菌素試驗陽性者的外周血單核細胞中出現增殖反應并產生較ESAT6分泌水平高的IFN-γ。根據其BCG缺失的特點，ESAT6-CFP10 蛋白已成為目前應用最為廣泛的診斷用抗原[9-10]。

表5 HRP-ELISA法標記抗原稀釋率的選擇

表6 Bio-ELISA法標記抗原稀釋率的選擇

表7 HRP-ELISA法和Bio-ELISA法對血清標本的檢測結果

圖1 HRP-ELISA法和Bio-ELISA法的散點圖（A）和ROC曲線（B）

我們使用HRP 和生物素標記融合抗原，其后經過一系列反應條件的優化，建立了2種Mtb雙抗原夾心ELISA 法，分別為HRP-ELISA 法和Bio-ELISA法，所確定的最佳抗原包被濃度依次為2和0.25 μg/mL，最佳樣品稀釋率均為100 μL 血清原液，最佳標記抗原稀釋率數依次為1∶500和1∶2000。用建立的抗體檢測方法對71份TB 患者和90份健康對照血清進行初步臨床應用，比較分析后發現Bio-ELISA 法的靈敏度、P/N 值和AUC 均顯著高于HRP-ELISA法，這是因為生物素標記的蛋白具有多價性，且標記后的抗原生物活性不變，而每個SA 有4 個生物素結合位點，可同時以多價形式結合到生物素化大分子衍生物和標志物上，因此BAS 具有多級放大作用。雖然2 種方法的特異性均為100%，但Bio-ELISA 法的P/N 值（74.92）顯著大于HRP-ELISA 法（9.42），且Bio-ELISA 法的AUC 值也高于HRP-ELISA 法，表明Bio-ELISA 法區分陰性和陽性樣本的能力顯著高于HRP-ELISA法，試劑的檢測性能更好。

綜上所述，本研究建立的2種雙抗原夾心ELISA法均適用于TB 的臨床輔助診斷，其中Bio-ELISA 法的診斷性能明顯優于HRP-ELISA 法，更加適合用于TB的臨床輔助診斷。

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