重組抗CD52人源化單克隆抗體ELISA檢測方法的建立

李金龍 ，胡百卉，許先興，張代超，劉運(yùn)龍，陳知航，程遠(yuǎn)國

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，吉林 長春 130062；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物與流行病研究所，北京 100071；3.第二炮兵總醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100088

慢性B 淋巴細(xì)胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）是一種B 淋巴細(xì)胞克隆性增殖的腫瘤性白血病，特點(diǎn)為血液、骨髓和淋巴組織中大量單克隆的成熟小B 淋巴細(xì)胞的增殖[1]。CLL 在西方國家是最常見的成人白血病類型，在亞洲國家少見[2]。

CD52 是細(xì)胞表面的一種相對分子質(zhì)量為21×103～28×103的糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidyl inositol，GPI）錨定糖蛋白抗原，但去掉糖基后它的相對分子質(zhì)量只有8×103～9×103[3]。成熟CD52 的蛋白結(jié)合部分僅含12 個(gè)氨基酸殘基（GQNDTSQTSSPS），C 端通過GPI 錨定分子連接于細(xì)胞膜表面，N 端3 位天冬酰胺殘基連接有一個(gè)復(fù)雜的糖基，在其四角巖藻糖基化的甘露糖核心上有幾個(gè)唾液酸化的多聚乳糖胺單位[4-6]。CD52分布比較廣泛，一般表達(dá)于正常及惡性的B 和T 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面及男性的生殖系統(tǒng)組織中[7]。多個(gè)志愿者來源的樣本分析表明CD52 不表達(dá)于紅細(xì)胞與造血干細(xì)胞[8]。

Campath 是一種抗CD52 的單克隆抗體，通過哺乳動物細(xì)胞（CHO）懸浮培養(yǎng)制備而得，為IgG1 亞型，具有人類抗體可變區(qū)的框架區(qū)及恒定區(qū)和鼠單克隆抗體（Campath-1G）互補(bǔ)決定區(qū)，相對分子質(zhì)量約為150×103。Campath 作為一種抗CD52 的單克隆抗體，能特異地識別表達(dá)在所有淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞表面的CD52 抗原，并與之結(jié)合殺傷淋巴細(xì)胞[9]，其作用機(jī)制可能包括與白血病細(xì)胞表面的CD52 抗原結(jié)合后直接誘導(dǎo)凋亡、通過補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用殺傷靶細(xì)胞（CDC 作用），以及抗體依賴的溶細(xì)胞作用殺傷靶細(xì)胞（ADCC 作用），從而達(dá)到治療相關(guān)疾病的目的。

目前已報(bào)道的檢測血清中抗CD52 單克隆抗體的方法很多，多數(shù)為ELISA，其他方法還有免疫熒光法、細(xì)胞放射免疫法等。但這些方法存在檢測復(fù)雜、耗時(shí)長、靈敏度低等問題，如ELISA 的定量限（LOQ）為0.5～6.6 μg/mL，流式細(xì)胞法的LOQ 為0.1～1 μg/mL[10]。在本研究中，我們擬于建立一種靈敏、特異、快速的雙抗夾心ELISA 法，用于檢測食蟹猴血清中抗CD52 單克隆抗體的濃度。我們采用的包被抗體與檢測抗體都是猴血清吸附的羊抗人IgG，此多抗既可捕獲又可用于檢測抗CD52單克隆抗體，而且該多抗是經(jīng)過猴血清吸附特殊處理過的，這樣可以將與猴IgG 結(jié)合的那部分羊抗人IgG 除去。這種測定方法的靈敏度、準(zhǔn)確性和特異性都非常高，并可成功地用于支持抗CD52 單克隆抗體臨床前動物試驗(yàn)研究的藥代動力學(xué)分析。

1 材料和方法

1.1 材料

重組抗CD52 單克隆抗體體注射液（HS020）由浙江海正藥股份有限公司提供，濃度為30 mg/mL，于4℃保存；猴血清吸附的羊抗人IgG（1 mg/kg）、猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP（1 mg/kg）購于Bethyl公司；牛血清白蛋白（BSA）購于羅氏公司；CHAPS購于Sigma 公司；Proclin300 購于Supelco Analytical 公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB 顯色液）購于Aladdin 公司；聚苯乙烯96 孔酶標(biāo)板購于Costar 公司；酶標(biāo)儀購于BIO-RAD公司；其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

試劑配制：①pH7.4 磷酸鹽緩沖液（PBS）：稱取16 g NaCl、0.4023 g KCl、2.84 g Na2HPO4、0.544 g KH2PO4，溶解于2 L ddH2O，pH7.4；②包被液：取0.2 mol/L 碳酸鈉水溶液16 mL 和0.2 mol/L 碳酸氫鈉水溶液34 mL，加蒸餾水至200 mL；③封閉液：PBS，2% BSA，0.05% P20，0.05% Proclin300，0.25% CHAPS，5 mmol/L EDTA，0.35 mol/L NaCl，pH8.0，總體積200 mL；④稀釋液：PBS，0.5% BSA，0.05% P20，0.05% Proclin300，0.25% CHAPS，5 mmol/L EDTA，0.35 mol/L NaCl，pH8.9，總體積200 mL；⑤TMB 顯色液：將A 液與B 液等體積混合，現(xiàn)用現(xiàn)配；⑥終止液（1 mol/L 硫酸）：將10.4 mL 硫酸（98%）緩慢加入189.6 mL 蒸餾水中，邊加入邊攪拌，總體積200 mL；⑦ELISA 洗板液：將0.5 mL Tween-20加入999.5 mL磷酸鹽緩沖液中；⑧標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：先將重組抗CD52 單克隆抗體稀釋至500 ng/mL，之后再梯度稀釋至7.81 ng/mL。

1.2 檢測步驟

①包被：用pH9.6 的碳酸鹽緩沖液包被猴血清吸附的羊抗人IgG 單克隆抗體，稀釋至5 μg/mL，100 μL/孔，4℃過夜；②封閉：用洗液洗板3 次，拍干酶聯(lián)板，加封閉液200 μL/孔，室溫封閉2 h；③加樣：用洗液洗板4 次，拍干酶聯(lián)板，用20%的食蟹猴空白血清稀釋不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，每孔加100 μL，室溫孵育1 h；④加二抗：用洗液洗板6次，拍干酶聯(lián)板，每孔加100 μL 猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP（1∶40 000 稀釋），室溫孵育1 h；⑤顯色：用洗液洗板6次，拍干酶聯(lián)板，加1∶1混合的TMB顯色液A、B 液，100 μL/孔，室溫孵育15 min；⑥終止：加終止液100 μL/孔，30 min 內(nèi)讀數(shù)；⑦比色：分別讀取D450nm和D560nm值。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

將重組抗CD52 單克隆抗體用20%猴血清稀釋至500、250、125、62.5、31.25、15.63 及7.81 ng/mL，取100 μL 樣品，依據(jù)上述步驟檢測。以D值為縱坐標(biāo)、各標(biāo)準(zhǔn)管濃度為橫坐標(biāo)，對其進(jìn)行非線形回歸運(yùn)算。測得重組抗CD52 人源化單克隆抗體在7.81～500 ng/mL 范圍內(nèi)，蛋白濃度（ng/mL）的對數(shù)值與免疫反應(yīng)光吸收（D值）呈S 狀形曲線，經(jīng)四參數(shù)Logistic 函數(shù)曲線模型擬合，求得曲線斜率、EC50，及上下端漸進(jìn)線間的近線性范圍。擬合曲線見表1 和圖1。其數(shù)學(xué)模型為：

2.2 方法的靈敏度與最低檢測濃度

按照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法制成7.8 ng/mL 的重組抗CD52人源化單克隆抗體，同樣按上述方法進(jìn)行測定，重復(fù)6 次，由同一板上的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出的濃度為抗CD52 單抗檢出量。最低定量下限滿足方法學(xué)要求，CV為4.9%，RE為+10.8%，確定檢測的最低定量下限為7.8 ng/mL。

2.3 方法的精密度與準(zhǔn)確度

同樣按上述方法測定400、62.5、15.6 ng/mL 高、中、低三種濃度，每個(gè)濃度平行測定6 次，共測定3次，分別計(jì)算批內(nèi)與批間的CV值與RE值。結(jié)果顯示在高、中、低三種濃度水平下測定的批內(nèi)與批間CV值均小于10%，說明檢測方法具有較高的精密度；批內(nèi)與批間的RE值均小于10%，說明檢測方法具有較高的準(zhǔn)確度。

2.4 方法的回收率

按照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法制成400、62.5、15.6 ng/mL（高、中、低）三個(gè)濃度的受試品重組抗CD52人源化單克隆抗體的質(zhì)控樣品，同樣按上述方法進(jìn)行測定，重復(fù)6 次，由同一板上的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出的濃度為重組抗CD52 人源化單克隆抗體的檢出量。

2.5 方法的特異性

分別做PEG-EPO（促紅細(xì)胞生成素）、IL-2（白細(xì)胞介素2）、GH（生長激素）和受試品抗CD52 單抗的校正標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明抗CD52單抗沒有與前三者發(fā)生交叉反應(yīng)（圖2）。

圖1 重組抗CD52人源化單克隆抗體的四參數(shù)校正曲線

圖2 受試品CD52與PEG-EPO、GH、IL-2的校正曲線

2.6 樣品的穩(wěn)定性

從標(biāo)準(zhǔn)曲線選取高、中、低三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度6 個(gè)樣本，在-20℃冰箱中冷凍后取出，室溫融化，反復(fù)3 次，測定其濃度，確定凍融穩(wěn)定性；室溫保持4 h 后，測定其濃度，確定室溫穩(wěn)定性；4℃冰箱中放置24 h后，測定其濃度，確定4℃24 h短期穩(wěn)定性；-80℃冰箱中冷凍120 d 后取出，室溫融化，測定其濃度，確定長期穩(wěn)定性。結(jié)果表明，重組抗CD52 單克隆抗體在血清中凍融3 次、室溫放置4 h、4℃冰箱中放置24 h、-80℃長期保存均不影響其穩(wěn)定性。

2.7 樣品稀釋率的影響

將重組抗CD52 單克隆抗體稀釋至100 μg/mL后，分別進(jìn)行1/250、1/1600、1/6400 稀釋，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔進(jìn)行測定，結(jié)果見表6，各稀釋率對樣品檢測無影響，不存在稀釋效應(yīng)。

2.8 小結(jié)

上述方法學(xué)確證結(jié)果表明，本研究建立的方法的特異性、板內(nèi)和板間精密度、最低定量下限、回收率、穩(wěn)定性及樣品稀釋率的影響均滿足生物樣品分析要求，可用于重組抗CD52單克隆抗體的藥代動力學(xué)研究。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

表2 ELISA檢測加入猴血清中受試物的抗體的靈敏度

表3 ELISA檢測加入猴血清中受試物的抗體的精密度與準(zhǔn)確度

表4 ELISA檢測加入猴血清中受試物的抗體的回收率

表5 重組抗CD52人源化單克隆抗體的穩(wěn)定性

表6 樣品稀釋率的影響

3 討論

檢測生物樣本中重組抗CD52 單克隆抗體的方法很多，但各有優(yōu)缺點(diǎn)。抗體依賴細(xì)胞毒性（ADCC）法的靈敏度較高，檢測抗體濃度可達(dá)0.01 μg/mL 以下，但此方法需用新鮮血作為效應(yīng)細(xì)胞，而供血者之間的差異很難使檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化，也很難保證方法的精確度。補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞毒（CDC）法的優(yōu)點(diǎn)是供血者之間補(bǔ)體變化不大，可獲得大量試驗(yàn)用血清，但血清中補(bǔ)體抑制因子變異較大，當(dāng)血清濃度過高時(shí)可抑制CDC 反應(yīng)，因此在檢測時(shí)必須盡量稀釋血清樣品，或在加入血清樣品和補(bǔ)體過程中增加清洗步驟，因而檢測靈敏度大大降低。放射免疫法是將人的T細(xì)胞固定在微孔板上，加入稀釋的重組抗CD52單克隆抗體或待測血清，然后加入放射性標(biāo)記的重組抗CD52 單克隆抗體，檢測靈敏度較高，可達(dá)0.1 μg/mL，但中和抗體的出現(xiàn)會嚴(yán)重干擾試驗(yàn)結(jié)果。免疫熒光法功能強(qiáng)大，無論是靈敏度、精密度還是準(zhǔn)確度都能滿足檢測需求，檢測CD52單抗的最低檢測限可達(dá)0.5 μg/mL，但流式細(xì)胞檢測方法相對復(fù)雜，并且耗時(shí)較長，該方法的一個(gè)特點(diǎn)是只有具有抗原結(jié)合位點(diǎn)和Fc 片段的生物活性抗體才能被檢測，已通過突變結(jié)合位點(diǎn)試驗(yàn)加以證明，潛在的干擾是靶細(xì)胞與人血清中正常的IgG 及其他人抗體結(jié)合。ELISA法檢測治療性單克隆抗體可用重組抗原或抗獨(dú)特型抗體捕獲待檢抗體，但實(shí)際上如果沒有特異性的捕獲抗體和檢測抗體，那么抗CD52單抗必然會與正常猴IgG 發(fā)生交叉反應(yīng)，且使本底值升高，靈敏度下降，其檢測靈敏度為0.06～6.6 μg/mL，這就是ELISA靈敏度不高的原因。

綜上所述，為了提高檢測靈敏度，縮短檢測時(shí)長，使檢測方法更便捷，我們研究了一種生物分析藥代動力學(xué)測定法——雙抗夾心ELISA，用于檢測食蟹猴血清中抗CD52 單克隆抗體的濃度。此方法不依賴于抗CD52單抗的特異性，包被抗體和檢測抗體都是羊抗人IgG，該抗體既可用于捕獲又可檢測抗CD52抗體，且經(jīng)猴血清吸附過后可排除猴血清成分的干擾，提高測定的特異性、準(zhǔn)確性和靈敏度。因?yàn)榇朔椒ㄊ且匀薎gG 為特異性的，而不僅僅是以抗CD52 單抗為特異性的，所以該法的應(yīng)用性更廣泛，不僅可支持抗CD52 單抗猴實(shí)驗(yàn)研究的藥代動力學(xué)分析，同時(shí)也可測定非靈長類和嚙齒類動物血清中的人IgG 或人源化IgG 分子，如Cetuximab（西妥昔單抗）、Trastuzumab（曲妥珠單抗）等。但是，當(dāng)動物被給予多種人源化單抗時(shí)，此檢測方法只能檢測出生物體內(nèi)總的單抗水平，無法得出單一單抗水平。

總之，應(yīng)用此方法，我們可以快速、準(zhǔn)確地檢測出食蟹猴血清中人源化IgG，而無須特異性試劑。

[1]Sabattini E，Bacci F，Sagramoso C，et al.WHO classification of tumours ofhaematopoietic and lymphoid tissues in 2008:an overview[J].Pathologica,2010,102(3):83-87.

[2]StatBite:estimated new cases for the four major leukemias,2008[J].J Natl Cancer Inst,2009,101(6):371.

[3]屈浩,CD52抗原的研究進(jìn)展及其抗體在臨床中的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊,2005,11(8):367-373.

[4]Rowan W,Tite J,Topley P,et al.Cross-linking of the CAMPATH-1 antigen(CD52) mediates growth inhibition in human B-and T-lymphoma celllines,and subsequent emergence of CD52-deficient cells[J].Immunology,1998,95:427-436.

[5]Hederer R A,Guntermann C,Miller N,et al.CD45 tyrosine phosphatase regulates Campath-1H(CD52)-induced TCR-dependent signal transduction in human T cells[J].Int Immunol,2000,12:505-516.

[6]Nuckel H,Frey U H,Roth A,et al.Alemtuzumab induces enhanced apoptosis in vitro in B-cells from patients with chronic lymphocytic leukemia by antibody-dependent cellular cytotoxicity[J].Eur J Pharmacol,2005,514(2-3):217-224.

[7]Ginaldi L,De Martinis M,Matutes E,et al.Levels of expression of CD52 in normal and leukemic B and T cells:correlation with in vivo therapeutic responses to Campath-1H[J].Leukemia Res,1998,22(2):185-191.

[8]Quigley M M,Bethel K J,Sharpe R W,et al.CD52 expression in hairy cell leukemia[J].Am J Hematol,2003,74(4):227-230.

[9]Rowan W,Tite J,Toplly P,et al.Cross-linking of the CAMPATH-1 antigen(CD52) mediates growth inhibition in human B-and T-lymphoma cell lines,and subsequent emergence of CD52-deficient cells[J].Immunology,1998,95(3):427-436.

[10]Kümler I,Tuxen M K,Nielsen D L,et al.A systematic review of dual targeting in HER2-positive breast cancer[J].Cancer Treatment Rev,2013,9:1-12.

[11]Cartron C,Blasco H,Paintaud C,et al.Pharmacokinetics of rituximab and its clinical use;thought for the best use[J].Crit Rev Oncol/Hematol,2007,62:43-52.

[12]Yang Jihong,Ng C,Lowman H,et al.Quantitative determination of humanized monoclonal antibody rhuMAb2H7 in eynomolgus monkey serum using a genric immunoglobulin pharmacokinetic assay[J].J Immunol Methods,2008,335:8-20.