LSECtin-CRD-GST融合蛋白的原核表達、純化及復性

汪明群 ，叢建波，程莉，董國福，王少霞，鄭文，王長振，吳可

1.宜賓市第一人民醫(yī)院，四川 宜賓 644000；2.軍事醫(yī)學科學院 放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850

C 型凝集素樹突細胞特異性細胞間黏附分子3結(jié)合非整合素分子（dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN）家族成員肝臟免疫調(diào)控蛋白LSECtin（liver and lymph node sinusoidal endothelial cell Ctype lectin）是近年來克隆鑒定的新型凝集素蛋白，在肝臟和淋巴結(jié)表達[1-2]，活體分離的外周血和胸腺樹突細胞（DC）及體外培養(yǎng)的活化巨噬細胞也有表達[3]，并被證實是肝臟重要的免疫調(diào)控蛋白[4-5]。其基因與DC-SIGN、DC-SIGNR（DC-SIGN related protein）和CD23 的基因緊密排列于染色體19p13.3 區(qū)域。它們均屬于Ⅱ型C 型凝集素家族，具有相似的結(jié)構(gòu)，由一個N 端的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、一個穿膜部分、一個含卷曲螺旋的頸部結(jié)構(gòu)域和一個C 端糖基識別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate recognition domain，CRD）組成，其中CRD 結(jié)構(gòu)域是參與病毒感染及配體結(jié)合的主要功能結(jié)構(gòu)域[1,6]。近年來對LSECtin 分子的研究雖有較多進展，但對其功能結(jié)構(gòu)域在溶液狀態(tài)的結(jié)構(gòu)特點及其在與配體相互作用時的動態(tài)結(jié)構(gòu)變化并未得到很好的闡明，這也是該領(lǐng)域研究中需要解決的重點和熱點問題。

我們擬采用基因克隆的方法構(gòu)建LSECtin-CRD的原核表達載體，并對其表達純化，旨在獲得足量可溶融合蛋白，為后續(xù)LSECtin-CRD 結(jié)構(gòu)域的功能與構(gòu)象變化研究打下實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

LSECtin-CRD 模板（軍事醫(yī)學科學院蛋白質(zhì)組與基因組學實驗室提供）；pGEX-6p-1（中國農(nóng)業(yè)科學院質(zhì)標所惠贈）；大腸桿菌DH5α、Origami（DE3）感受態(tài)細胞（Novagen 公司）；高保真DNA 聚合酶，DNA純化試劑盒，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ（Promega公司）；DL2000 DNA marker、λHindⅢ、T4DNA 連接酶（NEB 公司）；蛋白質(zhì)分子量marker（Fermentas 公司）；GST 抗體、HRP 標記的羊抗兔抗體（Santa Cruz Biotechnology公司）。

1.2 原核表達載體構(gòu)建

根據(jù)LSECtin 基因序列和原核表達載體pGEX-6p-1 的多克隆位點設(shè)計上游引物P1（5'-CCGGAA TTCGGCTCCTGCTACTTTTT-3'）和下游引物 P2（5'-CCCGCGGCCGCGCAGTTGTGGCCTTTTCT-3'）。上、下游引物分別引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點。用上述引物以LSECtin 為模板擴增360 bp 的LSECtin-CRD 基因序列，目的片段純化、EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的原核表達載體pGEX-6p-1 用T4DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，陽性克隆經(jīng)酶切和測序鑒定。

1.3 重組表達載體的誘導表達

將測序正確的表達質(zhì)粒pGEX-6p-1-LSECtin-CRD 轉(zhuǎn)化宿主菌Origami（DE3）進行重組蛋白誘導表達。小量菌種培養(yǎng)過夜，1%接種量轉(zhuǎn)接后，D600nm為0.5～0.8 時加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，20℃低溫誘導6 h，離心收集菌體，用TBS 吹勻，洗3 次，離心后加TBST，超聲波破碎（超聲3 s 停2 s，共5 min,連續(xù)3 次后停5 min，重復操作5～8 次，直至溶液變得澄清），將得到的樣品（未誘導全菌為陰性對照）經(jīng)SDS-PAGE檢測。

1.4 包涵體的復性、純化及Western印跡鑒定

將誘導表達的菌液于5000 r/min 離心10 min，棄上清，用TBS 洗2 次，收集菌體，按每克菌體加10 mL STET 緩沖液（pH8.0）的比例重懸，超聲波破菌后1000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用10 mL包涵體洗滌液洗滌3 次，再用9 倍體積的含4 mol/L 尿素的TE 緩沖液（含20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0）洗滌，過夜，分別保留上清和沉淀，按10 mL/g 的比例用含8 mol/L 尿素的緩沖液（含0.2 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，pH8.0）溶解沉淀，4℃攪拌過夜，4℃低溫離心，上清即為目的蛋白。上述包涵體裂解液用含8 mol/L 尿素的緩沖液（含20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0）稀釋至0.2 mg/mL，加入DTT 至終濃度1 mmol/L，室溫放置4 h，用含4、3、2 mol/L 尿素的透析外液（含20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，3 mmol/L GSH，0.5 mmol/L GSSG，pH8.0）進行4℃梯度透析復性24 h，將復性的溶液進行GST 柱親和純化，SDS-PAGE 檢測收集流出液，對純化的蛋白進行Western印跡鑒定。

對純化蛋白進行12% SDS-PAGE；選用標準濕式轉(zhuǎn)膜裝置，將蛋白移到PVDF 膜，設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300～400 mA，時間為60 min，為了避免發(fā)熱現(xiàn)象，將轉(zhuǎn)膜槽置于冰浴中；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，把PVDF 膜置入洗滌液漂洗2 min，去除洗滌液，加入含5%脫脂牛奶的TBST封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60 min；用兔源單克隆抗體GST（1∶1000）孵育，4℃緩慢搖動過夜，TBST 洗3 次，每次10 min；用羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗3次，每次10 min；ECL暗室曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 pGEX-6p-1-LSECtin-CRD原核表達載體的構(gòu)建

用EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切膠回收擴增的目的基因小片段，與同樣經(jīng)雙酶切的質(zhì)粒載體大片段連接后構(gòu)建表達載體pGEX-6p-1-LSECtin-CRD，挑克隆擴大培養(yǎng)，酶切鑒定（圖1），顯示250～500 bp有特異的DNA 帶，大小與預計相符，初步表明目的片段已成功插入。對呈陽性結(jié)果的克隆保存菌種，取1.0 mL送Invitrogen 公司測序，結(jié)果表明基因序列正確匹配，被測片段包括了編碼LSECtin-CRD 的全部核苷酸序列及兩端的引物。

2.2 LSECtin-CRD-GST融合蛋白的誘導表達

將酶切鑒定及測序正確的pGEX-6p-1-LSECtin-CRD 轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami（DE3）宿主菌，外源基因表達后離心收集融合蛋白，SDS-PAGE 檢測表達情況，結(jié)果見圖2，在相對分子質(zhì)量約40×103處有蛋白表達，與預計的融合蛋白大小吻合，表明表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌后誘導出大量融合蛋白，但以包涵體形式存在，上清液里未發(fā)現(xiàn)可溶蛋白。

2.3 包涵體的復性、純化及Western印跡鑒定

對包涵體進行洗滌裂解及梯度透析復性處理后用GST柱親和純化，純化的樣品經(jīng)SDS-PAGE（圖3）分析，結(jié)果顯示獲得純度高的目的蛋白。Western 印跡（圖4）檢測證明目的蛋白有特異的GST抗原性。

圖1 pGEX-6p-1-LSECtin-CRD表達載體的雙酶切鑒定

圖2 pGEX-6p-1-LSECtin-CRD在宿主菌中的誘導表達

圖3 融合蛋白純化的SDS-PAGE分析

圖4 Western印跡驗證融合蛋白

3 討論

LSECtin 系肝臟及淋巴結(jié)竇內(nèi)皮細胞C 型凝集素，屬于疏水性強、富含二硫鍵的Ⅱ型跨膜糖蛋白。已有研究表明LSECtin-CRD在原核系統(tǒng)中以包涵體形式表達[5,7-8]。本實驗中，我們選擇了有助于膜蛋白二硫鍵正確折疊的表達載體pGEX-6p-1。pGEX 質(zhì)粒載體將基因或基因片段與GST 融合后，不但能在細胞內(nèi)高水平誘導表達，而且有助于提高表達蛋白的活性。我們還選擇大腸桿菌Origami（DE3）作為重組蛋白的宿主菌。Origami（DE3）是硫氧還蛋白還原酶（TrxB）突變的BL21 衍生菌，它能促進重組蛋白在胞質(zhì)中形成二硫鍵，而普通的大腸桿菌不利于二硫鍵的形成，并且在同類衍生菌中，Origami（DE3）形成二硫鍵的活力是最強的[9]。有研究表明，在整體水平相當?shù)那闆r下，采用Origami（DE3）宿主，曾使一個含二硫鍵的重組蛋白的表達活性提高了10 倍[10]，同樣是包涵體，但用Origami（DE3）宿主菌更有利于翻譯后修飾，有效降低了重組蛋白的無序聚集，有益于下一步的復性。

雖然我們在低溫、低IPTG 濃度、豐富培養(yǎng)基、短時誘導、錯開目的蛋白等電點等方面進行了摸索，依然沒能實現(xiàn)目的蛋白的可溶性表達。但本實驗揭示宿主菌Origami 與表達載體pGEX-6p-1 是一對較佳的組合，這一組合有效地提高了表達蛋白的活性，降低了重組蛋白的無序折疊，易化了后續(xù)復性工作，對表達融合蛋白具有重要的借鑒意義。

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