丙型肝炎病毒NS3-5B轉基因小鼠模型的構建

趙海衛 ，韓佩君，姚敏，呂欣，雷迎峰，楊敬，喬卿華，翁代慧，黨品香，尹文

第四軍醫大學 a.基礎醫學部微生物學教研室；b.西京醫院輸血科；陜西 西安 710032

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引起慢性肝病的主要病原體之一，目前全球至少有1.7億感染者。持續HCV 感染會引起肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌，至今尚無有效的預防性疫苗，干擾素聯合利巴韋林的標準療法雖有一定效果但仍有缺陷[1-2]。HCV 為單股正鏈RNA 病毒，屬于黃病毒科肝炎病毒屬，基因組全長9.6 kb，編碼10 個病毒蛋白，包括結構蛋白（Core、E1、E2）和非結構蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[3]。其中，非結構蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B聚集在感染細胞的內質網膜上形成復合物（復制復合體），為病毒RNA 的復制提供了穩定的微環境[4-6]。NS3 具有絲氨酸蛋白酶和RNA 解螺旋酶的雙重活性，前者在病毒前體蛋白成熟過程中發揮切割不同非結構蛋白的功能，后者在病毒RNA 復制中發揮解螺旋功能[7-8]。NS4A 作為NS3 蛋白酶活性的輔因子，與NS3 結合并輔助其錨定在內質網膜上[9]。NS4B 和NS5A 是病毒RNA 纏繞蛋白，是復制復合體形成的重要結構成分，并參與誘導內質網膜改變[4,10-11]。NS5B，即RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp），是病毒RNA 復制過程中的關鍵酶，已經成為抗HCV 治療的重要靶點之一[12]。最近，已有HCV RdRp 抑制劑（Sofosbuvir）獲準上市，該藥治療效果顯著，但成本高昂、臨床監測復雜使其難以被推廣使用[13]。缺乏表達RdRp 酶活性的體內試驗模型是HCV RdRp抑制劑研發緩慢的主要原因。

實際上，NS5B 蛋白雖是HCV RNA 復制過程中最關鍵的酶，但并不能僅依靠其單獨完成HCV 復制的整個過程，還需非結構蛋白NS3、NS4A、NS4B 和NS5A的輔助。HCV RNA的復制是在其非結構蛋白與宿主內質網膜所形成的復制復合體中進行的，因此，只有在HCV 復制復合體中才能更加真實地模擬HCV感染中RdRp酶的活性[6]。

我們前期已構建了表達HCV NS3-5B蛋白的體外模型[14]，但細胞環境并不能完全真實地模擬病毒感染宿主時機體的復雜內環境，與在體實驗相比還存在一定的局限性。因此，本研究以質粒pIRES2-EGFP-NS3-5B為基礎，構建表達HCV NS3-5B蛋白的轉基因小鼠，建立HCV 復制復合體的在體模型，為HCV感染中RdRp酶活性的評價提供研究平臺。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型C57BL/6 小鼠由第四軍醫大學實驗動物中心提供；質粒pIRES2-EGFP-NS3-5B[14]由本室構建；基因組DNA 提取試劑盒購自天根公司；PCR 試劑、DNA marker 和預染蛋白marker 均購自TaKaRa公司；TRIzol 總RNA 提取試劑盒、RNA 逆轉錄試劑盒購自Invitrogen 公司；RIPA 裂解液（強）購自碧云天公司；抗HCV NS5B 小鼠單克隆抗體由本實驗室制備；抗HCV NS3/4A 小鼠單克隆抗體和抗β-actin小鼠單克隆抗體均購自Abcam 公司；紅外標記兔抗鼠IgG 二抗購自LI-COR 公司；其余化學試劑均為國產分析純產品。

1.2 引物設計與合成

以pJ6/JFH-1（GenBank：AB114136.1）基因序列和β-actin（GenBank：NM001244575）基因序列為模板，相關引物設計如表1，所有引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.3 目的基因線性化及受精卵顯微注射

質粒pIRES2-EGFP-NS3-5B 經EcoRⅠ酶切，其線性化基因片段作為受精卵注射目的基因。瓊脂糖凝膠電泳純化目的基因，以野生型C57BL/6 雌性小鼠為實驗對象，按照常規方法進行受精卵顯微注射和胚胎移植[15]。

1.4 首建鼠的鑒定

4 周齡小鼠，剪取鼠尾1～2 cm，提取組織DNA，PCR 對HCV NS3 和NS5B 基因片段分別進行鑒定（擴增條件：94℃預變性5 min，94℃30 s、58℃30s、72℃2 min，共30 個循環），PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定；初鑒完成后，對鑒定陽性的小鼠，再通過PCR 進行NS3-5B 全長基因片段復鑒，上游引物為NS3引物F1，下游引物為NS5B 引物R2，反應條件為98℃10 s、68℃7 min，共30個循環，PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。初鑒與復鑒均陽性者為轉基因首建鼠。

表1 引物及序列

1.5 轉基因小鼠傳代與篩選

將轉基因首建鼠與野生型C57BL/6 小鼠交配，子代小鼠鑒定方法與首建鼠鑒定方法相同，篩選出F1代轉基因小鼠；將F1代轉基因小鼠繼續與野生型C57BL/6小鼠交配，鑒定并篩選出F2代轉基因小鼠，同樣方法傳代并篩選至F5 代轉基因小鼠；將F5 代雌雄轉基因小鼠進行交配，鑒定并篩選出遺傳性狀穩定的純合子轉基因小鼠，將純合子轉基因小鼠繼續繁育。

1.6 RT-PCR檢測

用TRIzol 總RNA 提取試劑盒提取轉基因小鼠肝組織總RNA，測定RNA 的濃度，按RNA 逆轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄為cDNA；以cDNA為模板，分別擴增NS3、NS5B（擴增條件同前）和內參βactin 基因片段（擴增條件：94℃預變性5 min，94℃30 s、58℃30 s、72℃30 s，共30 個循環），擴增產物經電泳鑒定。

1.7 Western印跡

用RIPA 裂解液提取C57BL/6 小鼠和轉基因小鼠的肝組織總蛋白，BCA 法進行蛋白定量。取50 μg總蛋白樣品，變性后經SDS-PAGE，電泳完成后將膠中蛋白條帶轉移至經甲醇浸泡過的PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉PVDF 膜2 h；加入用TBST 稀釋的抗HCV NS3/4A 小鼠單克隆抗體（1∶1000）、抗HCV NS5B小鼠單克隆抗體（1∶500）和抗β-actin 小鼠單克隆抗體（1∶1000），4℃搖床過夜；TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入TBST 稀釋的紅外標記二抗，避光室溫孵育2 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min，Odyssey紅外成像儀成像。

1.8 血清轉氨酶檢測

分別對6 周齡的10 只野生型C57BL/6 雄性小鼠和10 只純合子轉基因雄性小鼠摘眼球采血，分離血清檢測谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）。

1.9 病理學檢查

取6 周齡純合子轉基因小鼠的肝組織，用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片后做HE染色，分析組織病理形態。野生型C57BL/6小鼠為正常對照。

1.10 統計學分析

用SPSS 18.0 軟件進行統計學分析，P＜0.05 為差別有統計學意義。

2 結果

2.1 質粒pIRES2-EGFP-NS3-5B的構建及線性化

質粒pIRES2-EGFP-NS3-5B 示意圖見圖1，NS3-5B 基因片段在EcoRⅠ和BglⅡ位點與載體pIRES2-EGFP 連接。質粒pIRES2-EGFP-NS3-5B經EcoRⅠ酶切，其線性化目的基因片段大小為11 315 bp，電泳結果可見預期大小的目的基因（圖2）。

2.2 轉基因小鼠基因型鑒定

轉基因小鼠經PCR 擴增電泳鑒定，NS3 基因片段為1893 bp（圖3），NS5B 基因片段為1772 bp（圖4）；NS3 和NS5B 鑒定均陽性的小鼠的NS3-5B 全長基因為6009 bp（圖5）。NS3-5B 全長基因鑒定結果與NS3和NS5B基因鑒定結果一致，且目的基因片段大小與其實際大小相符。

圖1 質粒pIRES2-EGFP-NS3-5B示意圖

圖2 質粒pIRES2-EGFP-NS3-5B酶切線性化

圖3 轉基因小鼠NS3基因PCR擴增鑒定

2.3 RT-PCR 和Western 印跡檢測轉基因小鼠目的基因的表達

RT-PCR檢測轉基因小鼠肝組織中NS3和NS5B基因mRNA 的表達（圖6A），在肝組織中檢測到目的基因，大小與預期一致；Western 印跡檢測轉基因小鼠肝組織NS3/4A 和NS5B 蛋白的表達（圖6B），在肝組織中檢測到目的蛋白，大小與預期一致。

圖4 轉基因小鼠NS5B基因PCR擴增鑒定

圖5 轉基因小鼠NS3-5B基因PCR擴增鑒定

圖6 轉基因小鼠目的基因的表達

2.4 肝功能評價

實驗數據經Levene 方差齊性檢驗和近似t檢驗分析，結果表明轉基因小鼠ALT 值和AST 值與野生型C57BL/6 小鼠相比無顯著性差別（P＞0.05，表2），尚不能認為HCV NS3-5B 蛋白對小鼠肝臟有損傷。ALT和AST檢測結果如圖7所示。

2.5 組織形態分析

HE 染色結果表明6 周齡轉基因小鼠肝組織與野生型小鼠肝組織相比無形態學差異（圖8）。

3 討論

自HCV 被發現以來，研究者一直致力于抗HCV藥物研發，但目前HCV 感染的預防與治療仍然是醫學領域的一大難題。傳統的治療方法是聚乙二醇干擾素加利巴韋林聯合治療，但其對某些亞型HCV 的治療效果不佳，且易產生副作用[16]。NS5B 是由病毒自身編碼的、在HCV RNA 復制過程中起關鍵作用的RNA聚合酶，目前被認為是抗HCV治療的理想靶點之一[12]。實踐也證實RdRp 抑制劑（Sofosbuvir）治療HCV感染效果顯著[13]，但由于缺乏有效模擬RdRp酶活性的模型，極大地阻礙了RdRp 抑制劑的研發。HCV 感染機體時，病毒RNA 的復制是在其非結構蛋白與宿主內質網膜形成的復制復合體中完成的，因此，只有在復制復合體中才能更加真實地模擬HCV復制過程中RdRp 酶的活性。我們通過顯微注射法將質粒pIRES2-EGFP-NS3-5B 導入小鼠受精卵中，構建了HCV NS3-5B轉基因小鼠，經一系列鑒定，證實該轉基因小鼠目的基因成功表達，建立了HCV 復制復合體在體模型。

表2 ALT和AST相關參數（）

表2 ALT和AST相關參數（）

TG組為轉基因小鼠；WT組為野生型C57BL/6小鼠

圖7 野生小鼠與轉基因小鼠血清轉氨酶ALT和AST測定值

圖8 野生小鼠與轉基因小鼠肝組織HE染色（×200）

目前，已證實非結構蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B 共同參與完成HCV RNA 的復制，但其是否直接參與損傷肝組織尚無定論。本研究對6周齡轉基因小鼠血清ALT 和AST 進行了檢測，統計學分析結果與正常小鼠相比無顯著性差異，尚不能認為6 周齡轉基因小鼠HCV 非結構蛋白會損傷肝臟；但從其散點圖（圖7）離散趨勢可知部分轉基因小鼠ALT 值和AST 值較高，初步考慮可能與個體之間目的基因拷貝數不同有關。之前有研究發現6 月齡以上的HCV NS5A轉基因小鼠肝組織才會出現一定程度的病理改變，說明非結構蛋白對肝組織的損傷程度與其持續作用時間有關[17]。本研究中HE 染色未發現6 周齡NS3-5B 轉基因小鼠肝組織有任何形態改變，可能非結構蛋白對肝組織的作用時間較短，尚未造成病理變化。

綜上，我們構建了表達HCV NS3-5B 蛋白的轉基因小鼠模型，為HCV 感染中RdRp 酶活性的評價及其抑制劑的篩選提供了研究平臺。我們后續將通過對轉基因小鼠目的基因拷貝數、非結構蛋白表達量和生長周期等因素的研究，探討HCV 非結構蛋白與肝組織損傷的關系，并進一步構建用于RdRp酶抑制劑篩選的動物模型。

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