小鼠黑色素瘤相關抗原MART1的原核表達及抗體制備

李倩，孫鵬，楊建林，曹春雨，王艷林

三峽大學 醫學院 腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002

鼠黑色素瘤相關抗原（melanoma antigen recognized by T-cells 1，MART1）又稱Melan-A，主要存在于正常黑色素細胞或惡性黑色素腫瘤細胞中。作為一種特征性黑素瘤腫瘤抗原，MART1 的表達異常與惡性黑色素瘤發生與發展密切相關[1-2]。最新研究表明，MART1 中的抗原肽能夠被T 淋巴細胞識別并激發強烈的CTL 反應，提示MART1在黑色素瘤特異性免疫治療中潛在的應用價值[3-6]。我們擬在大腸桿菌中原核表達和純化MART1蛋白，并以此為抗原制備高效價的兔抗鼠多克隆抗體，以為MART1在抗腫瘤免疫治療中的應用研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

日本大耳白兔（雄性，2 kg）購自湖北省實驗動物中心；鼠黑色素瘤B16-F1 細胞株、大腸桿菌Rosseta（DE3）、質粒載體pET32a 為本實驗室保存；TRIzol 總RNA 純化試劑由Introvogen 公司提供；TaqDNA 聚合酶、限制性內切酶由Thermo 公司提供，Ni-NTA蛋白純化樹脂購于Qiagen公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、抗β-actin 和抗His 標簽單抗購自Sigma 公司；Rodamine 標記的山羊抗小鼠IgG 為北京中杉金橋公司產品；HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 多克隆抗體購自武漢博士德公司；PCR 引物合成及DNA測序由上海生工生物工程技術有限公司完成。

1.2 RT-PCR克隆小鼠MART1 cDNA

用TRIzol 試劑提取小鼠B16-F1 黑素瘤細胞總RNA，以該RNA 為模板、Oligo（dT）為引物，經逆轉錄酶M-MLV 催化，將mRNA 逆轉錄成cDNA 第一鏈，再以此cDNA 第一鏈為模板，用PCR 技術擴增出MART1 雙鏈DNA 編碼序列。PCR 上下游引物序列分別為5'-CGGAATTCATGCCCCAAGAAGACACAT TCA-3'和5'-AGCAAGCTTTCTCAGGGTGAATAAG GTGG-3'，在上下游引物的5'端分別引入酶切位點EcoRⅠ和HindⅢ（引物序列中下劃線部分）以便隨后的克隆操作。PCR 產物經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后克隆入pET32a 原核表達載體，用酶切和DNA測序鑒定所得重組質粒pET32a-MART1 中插入DNA序列和方向的正確性。

1.3 MART1的原核表達、純化及鑒定

用質粒pET32a-MART1 轉化大腸桿菌Rosseta（DE3）感受態細胞，培養至細菌處于對數生長期時，加入IPTG 至終濃度為0.3 mmol/L，誘導細菌表達重組蛋白5 h；離心收集誘導后的菌體，用裂解緩沖液（10 μmol/L 咪 唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4）重懸沉淀，超聲波裂解后取上清，上清中的MART1 重組蛋白用Ni-NTA 樹脂親和層析分離，咪唑濃度梯度洗脫獲得初步純化的MART1重組蛋白，再用制備性PAGE 進一步純化。用Western 印跡鑒定MART1 重組蛋白：樣品經SDS-PAGE 分離后電轉至PVDF膜，膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，與1∶1000稀釋的鼠源His 標簽抗體共孵育，低速搖床上4℃過夜，再與1∶5000 稀釋的HRP 標記的羊抗鼠IgG 室溫共孵育1 h，ECL顯影指示目標蛋白。

1.4 MART1多克隆抗體的制備

用純化的MART1 蛋白免疫雄性日本大耳白兔。首次免疫劑量500 μg/只，與等量弗氏完全佐劑混合后于脊柱兩旁皮下注射；間隔10 d 后進行第二次免疫，注射劑量為100 μg/只，與等量弗氏不完全佐劑混合后皮下注射；10 d 后同樣方法進行第三次免疫；第三次免疫1周后頸靜脈取血，分離血清。

1.5 ELISA檢測抗體效價

以純化的MART1 蛋白（2 μg/孔）為包被抗原，一抗為本實驗中制備的梯度稀釋的兔抗血清，二抗為HRP標記的羊抗兔IgG（1∶5000稀釋），TMB顯色，全波長酶標儀檢測光密度（D450nm）。

1.6 Western印跡檢測抗體的特異性

蛋白樣品包括IPTG 誘導前、后的大腸桿菌菌液，純化的MART1 蛋白和B16-F1 細胞裂解液。上述樣品經SDS-PAGE 分離后電轉至PVDF 膜，膜用5%脫脂牛奶封閉后，先后與本實驗自制的兔抗血清（1∶3000 稀釋）和HRP 標記的羊抗兔IgG（1∶5000 稀釋）共孵育，ECL顯影指示目標蛋白。

1.7 制備抗體用于免疫熒光染色

將B16-F1 細胞接種于事先放置有蓋玻片的6孔板中制備細胞爬片，培養24 h 后用40 g/L 多聚甲醛于4℃固定15 min，經5 mL/L TxitonX-100 透化處理15 min，10 mL/L山羊血清37℃封閉30 min，然后分別與本實驗制備的MART1抗血清（1∶500稀釋）和陰性對照（1×PBS 取代一抗）37℃共孵育2 h，加入羅丹明標記的羊抗兔IgG（1∶100 稀釋），37℃避光孵育30 min，熒光倒置顯微鏡下觀測并記錄結果。

2 結果

2.1 鼠MART1 編碼cDNA 的克隆與原核表達載體構建

如1.2所述方法構建重組質粒pET32a-MART1，重組質粒經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，獲得的限制性片段長度與理論預期一致（圖1），DNA 測序證實pET32a-MART1 中插入的DNA 序列、方向及讀框之間的對接均無誤。

2.2 MART1重組蛋白的原核表達、純化及鑒定

將重組質粒pET32a-MART1轉化大腸桿菌Rosseta（DE3）感受態細胞并用IPTG 誘導5 h 后，SDSPAGE 分析顯示誘導后的細菌中有一新生蛋白條帶出現，其分子大小與MART1重組蛋白預期相對分子質量一致（圖2）。該蛋白可經Ni-NTA 樹脂親和層析及切膠回收方法有效純化。Western 印跡分析證實該融合蛋白能與His標簽抗體特異性結合（圖3）。

2.3 抗MART1抗體的制備及效價鑒定

用上述實驗純化所得重組MART1 蛋白作為抗原免疫日本大耳白兔，經3 次皮下注射后，獲取免疫后的兔血清并用ELISA 法分析制備抗體的滴度和特異性。

用上述純化的同一批次的MART1 蛋白包被ELISA 檢測板，將抗體梯度稀釋（每個稀釋度設3 個復孔）后進行抗原-抗體結合反應，以高出對照血清D450nm值2.1 倍的制備血清抗體的最高稀釋度為抗體滴度。結果如圖4，本實驗所制備抗體的滴度為1∶1 024 000。

2.4 Western印跡鑒定制備抗體的特異性

Western 印跡結果顯示，制備的抗體能有效識別和結合原核表達的MART1 蛋白，在相對分子質量23×103處出現明顯的特異性反應條帶，其分子大小與預期一致（圖5）。另外，用16-F1細胞裂解液作為樣品進行的分析也能檢測出特異性條帶，表明本實驗制備的抗體能與真核細胞表達的MART1 抗原特異性結合（圖5）。

圖1 pET32a-MART1質粒的酶切鑒定

圖2 SDS-PAGE分析原核表達及純化的重組MART1

圖3 Western印跡分析原核表達和純化的MART1重組蛋白

同時，還用免疫熒光染色法檢測了制備抗體的特異性。制備B16-F1細胞爬片后，先后與制備抗體（一抗）和羅丹明標記的羊抗兔IgG（二抗）共孵育，然后在熒光顯微鏡下分析結果。結果顯示，制備抗體可以有效識別B16-F1細胞中的MART1蛋白（圖6）。

3 討論

為獲得大量可用作免疫抗原的小鼠MART1 蛋白，我們利用基因克隆技術將小鼠MART1基因全長編碼序列克隆到pET32a載體中，DNA 雙向測序證實構建的pET32a-MART1 重組質粒中外源DNA 片段插入方向及其與質粒中6×His 標簽編碼序列框架對接無誤，無移碼突變、堿基缺失等。在大腸桿菌原核表達系統中，IPTG 能高效誘導MART1 重組蛋白表達。由于重組蛋白N 端帶有6×His 標簽，我們用Ni-NTA 樹脂親和層析法純化MART1 重組蛋白。為得到更高純度的MART1 重組蛋白，我們將Ni-NTA 樹脂純化所得的蛋白樣品用制備性聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步純化。

圖4 ELISA檢測抗體效價

圖5 Western印跡檢測抗體的特異性

圖6 細胞免疫熒光分析制備抗體的特異性（×400）

為獲得抗MART1的多克隆抗體，我們利用上述純化的MART1 重組蛋白作為抗原免疫日本大耳白兔，經1 次啟動免疫和2 次強化免疫后，在實驗動物體內獲得高效價的抗MART1 多克隆抗體。經免疫印跡和細胞免疫熒光法分析證實，該抗體能有效識別和結合原核及真核細胞中表達的MART1蛋白，具有良好的特異性。

綜上所述，我們建立了小鼠MART1蛋白原核表達和純化技術，制備出的高效價和特異性抗MART1多克隆抗體將為黑色素瘤的防治研究提供技術支撐。

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